书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆犆犛犃 ４０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０２２６ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 　 /G2C /G2D /G2E /G2B /G2F /G30 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犲狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犿犻犮狉狅犫犻犪犾犿犲狋犪犵犲狀狅犿犲 — 犎犻犵犺狋犺狉狅狌犵犺狆狌狋狊犲狇狌犲狀犮犻狀犵 ２０２１  ０５  ２１ /G31 /G32 ２０２１  １２  ０１ /G33 /G34 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G31 /G32书 书 书目 　　 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… １ 　 范围 １ ……………………………………………………………………………………………………… ２ 　 规范性引用文件 １ ………………………………………………………………………………………… ３ 　 术语和定义 １ ……………………………………………………………………………………………… ４ 　 缩略语 ２ …………………………………………………………………………………………………… ５ 　 原理 ２ ……………………………………………………………………………………………………… ６ 　 试验条件 ２ ………………………………………………………………………………………………… ７ 　 试剂 ２ ……………………………………………………………………………………………………… ８ 　 仪器设备 ２ ………………………………………………………………………………………………… ９ 　 样品 ３ ……………………………………………………………………………………………………… １０ 　 试验步骤 ３ ………………………………………………………………………………………………… １１ 　 试验报告 ４ ………………………………………………………………………………………………… １２ 　 质量控制 ５ ………………………………………………………………………………………………… 附录 Ａ （ 规范性 ） 　 粪便样品采集 、 保存 、 运输方法 ６ ……………………………………………………… 附录 Ｂ （ 规范性 ） 　 土壤样品采集 、 保存 、 运输方法 ７ ……………………………………………………… 附录 Ｃ （ 规范性 ） 　 水体样品采集 、 保存 、 运输方法 ８ ……………………………………………………… 附录 Ｄ （ 资料性 ） 　 样品信息单 ９ …………………………………………………………………………… 附录 Ｅ （ 资料性 ） 　 ＤＮＡ 样品的完整性图谱和质量级别分类 １０ ………………………………………… 附录 Ｆ （ 资料性 ） 　 参考数据库 １１ …………………………………………………………………………… 参考文献 １２ …………………………………………………………………………………………………… Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０２２６ — ２０２１ 前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 深圳华大生命科学研究院 、 深圳华大基因科技有限公司 、 深圳市生命科技产学研资联盟 、 中国测试技术研究院生物研究所 、 深圳华大临床检验中心 。 本文件主要起草人 ： 陈冰 、 肖亮 、 钟焕姿 、 李俊桦 、 李倩一 、 贾慧珏 、 姜华艳 、 周李华 、 唐美芳 、 吴昊 、 李陶莎 、 周媛 、 钟宏彬 。 Ⅲ 犌犅 ／ 犜 ４０２２６ — ２０２１ 环境微生物宏基因组检测 　 高通量测序法 １ 　 范围 本文件描述了采用高通量测序技术进行环境微生物宏基因组检测的术语和定义 、 原理 、 试验条件 、 试剂 、 仪器设备 、 样品 、 试验步骤 、 试验报告和质量控制要求 。 本文件适用于运用高通量测序法进行环境微生物宏基因组的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文 件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于 本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析试验室用水规格和试验方法 ＧＢ１９４８９ 　 实验室 　 生物安全通用要求 ＧＢ ／ Ｔ３５５３７ — ２０１７ 　 高通量基因测序结果评价要求 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 环境 　 犲狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋 相对某项中心事物的周围世界 。 　　 注 ： 在本文件中特指人体 （ 动物 ） 环境与自然环境 。 人体 （ 动物 ） 环境包括但不限于口腔 、 皮肤 、 生殖道 、 肠道等 ； 自然 环境包括但不限于空气 、 水体 、 土壤 、 沉积物等 。 ３ ． ２ 相对丰度 　 狉犲犾犪狋犻狏犲犪犫狌狀犱犪狀犮犲 某一特定种类微生物在环境微生物群落中所占的相对比例 。 　　 注 ： 通常以百分比表示 。 ３ ． ３ 微生物宏基因组 　 犿犻犮狉狅犫犻犪犾犿犲狋犪犵犲狀狅犿犲 以特定环境中整个微生物群落作为研究对象 ， 不分离培养 ， 直接提取得到的所有微生物基因 组 ＤＮＡ 。 　　 注 ： 可用于分析其遗传信息 、 物种分类 、 系统进化 、 基因功能及代谢网络等 。 ３ ． ４ 碱基识别质量 　 狇狌犪犾犻狋狔狅犳犫犪狊犲犮犪犾犾犻狀犵 评价碱基准确识别的概率 。 　　 注 ： 简称为 Ｑ ， 通常以数值表示 。 碱基识别质量值与碱基识别错误率负相关 ， 二者遵循对数函数关系 。 碱基识别质 量值越高 ， 错误率越低 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０２２６ — ２０２１ ３ ． ５ 犙 ２０ 测序数据中 ， 碱基识别质量值为 ２０ 的碱基识别准确率为 ９９％ ， 或错误率为 １％ 。 ３ ． ６ 犙 ３０ 测序数据中 ， 碱基识别质量值为 ３０ 的碱基识别准确率为 ９９．９％ ， 或错误率为 ０．１％ 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＩＤ ： 识别码 （ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ５ 　 原理 运用高通量测序技术对环境样品中微生物基因组 ＤＮＡ 进行测序 ， 再将测序结果与现有数据库中 序列进行比对 ， 从而检测样品中所含微生物种类和相对丰度 。 ６ 　 试验条件 ６ ． １ 　 实验室设施和设备要求应符合 ＧＢ１９４８９ 的规定 。 ６ ． ２ 　 实验室用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 的规定 。 ６ ． ３ 　 实验室应做到防止污染 ， 应根据不同工作内容划分独立区域 ， 并有明显标志 ， 如试剂储备和准备 区 、 样品制备区 、 扩增区等 ， 各区域间应避免交叉污染 。 ７ 　 试剂 ７ ． １ 　 ＤＮＡ 提取试剂 。 ７ ． ２ 　 ＰＣＲ 产物纯化试剂 。 ７ ． ３ 　 文库制备试剂 。 ７ ． ４ 　 高通量测序试剂 。 ８ 　 仪器设备 ８ ． １ 　 高通量测序仪 。 ８ ． ２ 　 ＰＣＲ 仪 。 ８ ． ３ 　 冷冻离心机 ： 最大离心力 １２０００ 犵 以上 。 ８ ． ４ 　 微量移液器 。 ８ ． ５ 　 紫外分光光度计 。 ８ ． ６ 　 荧光定量仪 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０２２６ — ２０２１ ８ ． ７ 　 电泳仪 。 ８ ． ８ 　 凝胶成像系统 。 ８ ． ９ 　 水浴锅 。 ８ ． １０ 　 低温冰箱 ： －２０℃ 和 －８０℃ 。 ９ 　 样品 ９ ． １ 　 样品采集 、 保存和运输 ９ ． １ ． １ 　 样品采集应经过伦理审查和生物安全评价审查 。 ９ ． １ ． ２ 　 应即刻采样 ， 减少样品暴露于空气中的时间 ， 同时应避免样品被其他物质污染 。 ９ ． １ ． ３ 　 应根据环境样品类型等情况选择相应的采样方法以保证样品中微生物群落的代表性和准确性 。 粪便样品采集 、 保存和运输方法按附录 Ａ ， 土壤样品采集 、 保存和运输方法按附录 Ｂ ， 水体样品采集 、 保存和运输方法按附录 Ｃ 执行 。 ９ ． ２ 　 样品接收与处理 应核对样品编号 ， 记录样品信息 ， 检查样品状态 ， 避免密封不严导致泄漏或污染等 ， 否则该样品应废弃 ， 重新采样 。 应记录样品信息 （ 见附录 Ｄ ）， 以保证样品的可追溯性 。 １０ 　 试验步骤 １０ ． １ 　 犇犖犃 提取 １０ ． １ ． １ 　 原理 将环境样品悬浮于裂解缓冲液中 ， 通过抽提等步骤提取微生物基因组 ＤＮＡ ， 充分去除样品