书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３８５８０ — ２０２０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 犜犲犮犺狀犻犮犪犾狊狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀犳狅狉犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊犫狉犲犲犱犻狀犵狅犳犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊 ２０２０  ０３  ３１ /G2C /G2D ２０２０  ０３  ３１ /G2E /G2F /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2C /G2D书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 清华大学 、 洛阳华清天木生物科技有限公司 、 中国标准化研究院 。 本标准主要起草人 ： 张 罛 、 邢新会 、 李梅 、 剪兴金 、 王立言 、 郭肖杰 、 张乐乐 、 马爱进 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８５８０ — ２０２０ 微生物诱变育种技术规范 １ 　 范围 本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法 。 本标准适用于细菌 、 放线菌 、 酵母和霉菌等微生物的紫外 、 等离子体和化学诱变育种 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ１５１９３．１９ 　 食品安全国家标准 　 致突变物 、 致畸物和致癌物的处理方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 菌种 　 狊狋狉犪犻狀狊 面向工业 、 农业 、 食品 、 医药等用途 ， 在发酵过程中发挥生理代谢作用的微生物 。 ３ ． ２ 诱变 　 犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊 通过人为的措施诱导遗传物质产生突变的方法 。 ３ ． ３ 微生物诱变育种 　 犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊犫狉犲犲犱犻狀犵狅犳犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊 以人工诱变手段诱发微生物遗传物质发生突变 ， 并从突变群体中筛选出所需要的突变株 ， 进而培育成新品种的育种方法 。 ４ 　 要求 ４ ． １ 　 人员 试验人员应熟悉基本微生物操作 ， 在开展相关试验前应充分了解使用微生物 、 诱变剂存在的风险和安全操作规范 ， 试验过程中做好相应防护 。 ４ ． ２ 　 设施与环境 具有能开展基本微生物试验的实验室或车间 ， 配备相关水 、 电 、 气等基础设施 ； 实验室生物安全等级需满足所诱变微生物的要求 。 ４ ． ３ 　 诱变材料 ４ ． ３ ． １ 　 总则 诱变材料应遵循以下原则 ： １ 犌犅 ／ 犜 ３８５８０ — ２０２０ ａ ） 　 单个 、 分散的细胞 ， 宜呈悬浮状态 ； ｂ ） 　 细胞核越少越好 ， 最好是单核 ； ｃ ） 　 按照菌种类型选择合适的培养条件 ， 保证菌种具有旺盛的活力 ； ｄ ） 　 诱变材料制作过程应在超净工作台中进行 ， 所加试剂和溶液应提前进行灭菌或过滤除菌操作 。 ４ ． ３ ． ２ 　 菌悬液 将菌种接种至合适的培养基中 ， 培养至对数生长期 ， 离心收集菌体 ， 用无菌生理盐水洗涤两次 ， 再用适量生理盐水重悬使菌体浓度调整到 １×１０ ６ ＣＦＵ ／ ｍＬ ～ １×１０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 。 ４ ． ３ ． ３ 　 孢子悬浮液 将菌种接种至固体平板或斜面上培养至产生大量孢子 ； 用生理盐水洗脱并离心收集 。 用生理盐水洗涤两次 ， 再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使其充分分散 ； 过滤除掉菌丝体 。 最后用生理盐水悬浮得到均匀的孢子悬浮液 ， 并将其浓度调整到 １×１０ ６ ＣＦＵ ／ ｍＬ ～ １×１０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 。 ４ ． ３ ． ４ 　 菌丝悬浮液 将菌种接种到合适的培养基中培养至产生大量生长旺盛的菌丝 ， 取一定量菌液并离心收集 。 用生理盐水洗涤两次 ， 再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使菌丝断裂 ， 过滤除去未断裂的菌丝 。 最后用生理盐水悬浮得到均匀的菌丝悬浮液 ， 并将其浓度调整到 １×１０ ６ ＣＦＵ ／ ｍＬ ～ １×１０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 。 ４ ． ３ ． ５ 　 原生质体悬浮液 将菌种接种到合适的培养基上 ， 培养获得大量新鲜菌丝或孢子 ， 收集菌丝或孢子 。 用渗透压稳定剂洗涤两次并重悬 ， 向重悬液中加入一定量破壁酶 ， 在最适条件下酶解 ， 定时取样于显微镜下观察原生质体释放情况 。 酶解完成后过滤除去未酶解的菌丝 ， 离心收集原生质体 ， 用渗透压稳定剂洗涤原生质体三次 ， 并将其浓度调整到 １×１０ ６ ＣＦＵ ／ ｍＬ ～ １×１０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 诱变育种操作 ４ ． ４ ． １ 　 紫外诱变 紫外诱变育种操作要求如下 ： ａ ） 　 参数设定 ： 宜选择如下参数 ， 紫外线波长 ２６０ｎｍ ， 紫外灯功率 １０Ｗ ～ ３０Ｗ ， 照射距离 １０ｃｍ ～ ３０ｃｍ 。 细菌 、 原生质体 、 链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 １０ｓ ～ ９０ｓ ， 酵母 、 霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 １ｍｉｎ ～ １０ｍｉｎ 。 对于不同的微生物样品和诱变要求应优化选择合适的参数 。 ｂ ） 　 提前 ２０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 开紫外灯 。 ｃ ） 　 诱变材料应置于带无菌搅拌子的玻璃平皿中 ， 边照射边搅拌 。 ｄ ） 　 每个样品需设三个重复 ， 取相同的诱变材料作为阴性对照 ， 不照射紫外光 。 ｅ ） 　 诱变后所有步骤应在暗室红光灯下操作 。 ｆ ） 　 处理完成后的材料和阴性对照应避光冰浴 １ｈ ～ ２ｈ 。 ｇ ） 　 诱变后样品材料和阴性对照应进行梯度稀释 ， 吸取合适稀释度的菌液涂布固体平板 ， 避光培养至产生单菌落 。 ｈ ） 　 应统计诱变和阴性对照平板菌落数 ， 计算诱变致死率 。 ４ ． ４ ． ２ 　 常压室温等离子体诱变 常压室温等离子体诱变育种操作要求如下 ： ２ 犌犅 ／ 犜 ３８５８０ — ２０２０ ａ ） 　 参数设定 ： 宜选择如下参数 ， 照射功率 １００Ｗ ～ １２０Ｗ ， 照射距离 ２ｍｍ ， 工作气体流量 １０Ｌ ／ ｍｉｎ 。 细菌 、 原生质体 、 链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 ３０ｓ ～ ５ｍｉｎ ， 酵母 、 霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 １ｍｉｎ ～ ６ｍｉｎ 。 ｂ ） 　 每个样品应设三个重复 ， 取相同的诱变材料作为阴性对照 ， 阴性对照不照射等离子体 。 ｃ ） 　 照射结束后 ， 应立即把照射过样品放入准备好的预先加入培养基的无菌离心管中 ， 混合均匀 。 ｄ ） 　 处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释 ， 选择稀释度合适的菌液涂布固体平板 ， 培养至产生单菌落 。 ｅ ） 　 应统计诱变和阴性对照平板菌落数 ， 计算诱变致死率 。 ４ ． ４ ． ３ 　 化学诱变 化学诱变要求如下 ： ａ ） 　 化学诱变剂的选择 ： 宜根据诱变材料和诱变要求选择合适的化学诱变剂 ， 常用的化学诱变剂及其配制方法参见附录 Ａ 和附录 Ｂ 。 ｂ ） 　 化学诱变剂浓度 ： 不同微生物常用诱变剂浓度及处理时间参见附录 Ｃ 。 ｃ ） 　 在诱变材料中分别加入不同浓度梯度的诱变剂工作液 ， 混匀后处理不同时间 。 如需要应再加入反应终止液终止反应 ， 离心 ， 弃掉上清 ， 用无菌去离子水洗涤诱变处理过的菌体 。 ｄ ） 　 每个诱变剂量组或每个处理时间组应设三个重复 ， 阴性对照组不加入化学诱变剂 ， 以加入等量无菌水代替 。 ｅ ） 　 处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释 ， 选择稀释度合适的菌液涂布固体平板 ， 培养至产生单菌落 。 ｆ ） 　 应统计诱变和阴性对照平板菌落数 ， 计算诱变致死率 。 ｇ ） 化学诱变剂使用后应按 ＧＢ１５１９３．１９ 的方法进行处理 。 ５ 　 证实方法 诱变结果以致死率表示 ， 致死率按式 （ １ ） 计算 ： ＬＲ ＝ 犆 Ｃ － 犆 Ｔ 犆 Ｔ × １００％ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： ＬＲ ——— 致死率 ； 犆 Ｃ ——— 阴性对照平板菌落数 ； 犆 Ｔ ——— 试验组平板菌落数 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３８５８０ — ２０２０ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 化学诱变剂种类 、 作用机制及常用化学诱变剂 　　 化学诱变剂的种类 、 作用机制及常用化学诱变剂见表 Ａ．１ 。 表 犃 ． １ 化学诱变剂种类 作用机制 常用诱变剂 碱基类似物 代替 ＤＮＡ 中的正常碱基 ５ 溴尿嘧啶 （ ５ＢＵ ） ５ 氟尿嘧啶 （ ５ＦＵ ） ６ 氮杂尿嘧啶 （ ６ＮＵ ） ２ 氨基嘌呤 （ ２ＡＰ ） ６ 巯基嘌呤 （ ６ＭＰ ） ８ 氮鸟嘌呤 （ ８ＮＧ ） 烷化剂对 ＤＮＡ 分子中碱基 的烷基化修饰亚硝基乙基脲 亚硝基胍 硫酸二乙酯 硫酸 （ 磺酸 ） 酯类 甲基磺酸甲酯 甲基磺酸乙酯 移码诱变剂 移码突变吖啶橙 原黄素 氧化类诱变剂 ＤＮＡ 碱基氧化损伤 亚硝酸 （ 及其盐 ） 金属离子 机制尚不清楚 锰离子 ４ 犌犅 ／ 犜 ３８５８０ — ２０２０ 附 　 录 　 犅 （ 资料性附录