书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０５０ 犡 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３７０７７ — ２０１８ 禽蛋中胆固醇含量的测定 　 酶法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺狅犾犲狊狋犲狉狅犾犻狀犲犵犵狊 — 犈狀狕狔犿犪狋犻犮犿犲狋犺狅犱 ２０１８  １２  ２８ 发布 ２０１９  ０７  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 　 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７４ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 农业农村部家禽品质监督检验测试中心 （ 扬州 ）、 中国农业科学院家禽研究所 。 本标准主要起草人 ： 高玉时 、 葛庆联 、 马丽娜 、 唐修君 、 陈大伟 、 刘茵茵 、 张静 、 张小燕 、 蒲俊华 、 唐梦君 、 樊艳凤 、 顾荣 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３７０７７ — ２０１８ 禽蛋中胆固醇含量的测定 　 酶法 １ 　 范围 本标准规定了酶法测定禽蛋中胆固醇含量的方法 。 本标准适用于鸡蛋 、 鸭蛋 、 鹅蛋 、 鸽蛋 、 鹌鹑蛋等鲜禽蛋 。 本标准方法检出限为 １ｍｇ ／ １００ｇ ， 定量限为 ３ｍｇ ／ １００ｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 原理 胆固醇酯在胆固醇酯酶作用下水解为游离胆固醇和脂肪酸 ， 胆固醇在胆固醇氧化酶作用下 ， 生成 △ ４ 胆甾烯酮和 Ｈ ２ Ｏ ２ ， Ｈ ２ Ｏ ２ 在 ４ 氨基安替比林及苯酚参与下 ， 经过氧化物酶作用 ， 生成红色醌亚胺 。 在波长 ５０５ｎｍ 处测定样品吸光度 ， 醌亚胺吸光度与样品中胆固醇含量成正比 。 根据其吸光度与标准曲线比较或由标准曲线回归方程计算样品中胆固醇含量 。 ４ 　 试剂或材料 除非另有说明 ， 本标准所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的三级水 。 ４ ． １ 　 甲醇 （ ＣＨ ３ ＯＨ ）。 ４ ． ２ 　 乙醚 （ Ｃ ４ Ｈ １０ Ｏ ）。 ４ ． ３ 　 无水乙醇 （ Ｃ ２ Ｈ ６ Ｏ ）。 ４ ． ４ 　 氢氧化钾 （ ＫＯＨ ）。 ４ ． ５ 　 氯化钠 （ ＮａＣｌ ）。 ４ ． ６ 　 胆固醇酯酶 （ ＥＣ３．１．１．１３ ）： 来源于微生物 （ 如假单胞菌属 、 念珠菌属 ）， 葡萄糖氧化酶与尿酸酶含量小于 ０．０１％ ， 不含过氧化氢酶 ， 比活性约 １００ｋＵ ／ ｇ 酶蛋白 （ ２５℃ ， 胆固醇油酸酯为底物 ）。 ４ ． ７ 　 胆固醇氧化酶 （ ＥＣ１．１．１．６ ）： 来源于微生物 （ 如诺卡氏菌 、 球孢链霉菌 ）， 葡萄糖氧化酶与尿酸酶含量小于 ０．０１％ ， 不含过氧化氢酶 ， 比活性约 ４５ｋＵ ／ ｇ 酶蛋白 （ ３７℃ ， 胆固醇为底物 ）。 ４ ． ８ 　 过氧化物酶 （ ＥＣ１．１１．１．９ ）： 来源于辣根 ， 纯度值 （ Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｚａｈ１ 比值 ， 犃 ４０３ｎｍ ／ 犃 ２７５ｎｍ ） 约为 ３．０ ， 比活性 １０００ｋＵ ／ ｇ 酶蛋白 ［ ２５℃ ， ２ ， ２′ 连氮基  双  （ ３ 乙基苯并二氢噻唑啉 ６ 磺酸 ）（ ＡＢＴＳ ） 为底物 ］。 ４ ． ９ 　 胆固醇 （ Ｃ ２７ Ｈ ４６ Ｏ ， ＣＡＳ 号 ： ５７８８５ ）： 纯度 ≥ ９９％ 。 ４ ． １０ 　 氢氧化钾溶液 （ ６００ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ６００ｇ 氢氧化钾 ， 加水溶解并定容至 １０００ｍＬ ， 摇匀 。 ４ ． １１ 　 氯化钠溶液 （ ５０ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ５０ｇ 氯化钠 ， 加水溶解并定容至 １０００ｍＬ ， 摇匀 。 ４ ． １２ 　 磷酸氢二钠溶液 （ ０．３ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 １０７．４ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ）， 加水溶解并定容至 １０００ｍＬ ， 摇匀 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３７０７７ — ２０１８ ４ ． １３ 　 磷酸二氢钠溶液 （ ０．３ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ４６．８ｇ 磷酸二氢钠 （ ＮａＨ ２ ＰＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ）， 加水溶解并定容至 １０００ｍＬ ， 摇匀 。 ４ ． １４ 　 磷酸盐缓冲溶液 （ ０．３ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 量取 ８９．６ｍＬ 磷酸氢二钠溶液 （ ４．１２ ） 和 １０．５ｍＬ 磷酸二氢钠溶液 （ ４．１３ ）， 混匀 ， 必要时用盐酸溶液或氨水溶液调节 ｐＨ 值至 ７．７±０．０２ 。 ４ ． １５ 　 显色剂 ： 取 ８０Ｕ ／ Ｌ ～ １００Ｕ ／ Ｌ 的胆固醇酯酶 、 ４０Ｕ ／ Ｌ ～ ６０Ｕ ／ Ｌ 的胆固醇氧化酶 、 １０００Ｕ ／ Ｌ ～ １５００Ｕ ／ Ｌ 的过氧化物酶 、 １７２．０ｍｇ 胆酸钠 （ Ｃ ２４ Ｈ ３９ ＮａＯ ５ ）、 １０．２ｍｇ４ 氨基安替比林 （ Ｃ １１ Ｈ １３ Ｎ ３ Ｏ ）、 ３３．０ｍｇ 苯酚 （ Ｃ ６ Ｈ ５ ＯＨ ）、 ３００．０ｍｇ 聚乙二醇辛基苯基醚 （ ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ） 置于 １００ｍＬ 的容量瓶中 ， 用 ０．３ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲溶液 （ ４．１４ ） 稀释至刻度 。 临用时配制 。 ４ ． １６ 　 胆固醇标准储备液 （ ２．０ｍｇ ／ ｍＬ ）： 准确称取 ２００．０ｍｇ 胆固醇 ， 加无水乙醇溶解并定容至 １００ｍＬ ， 摇匀 。 置于 ４℃ 冰箱中 ， 有效期 ６ 个月 。 ４ ． １７ 　 胆固醇标准系列工作液 ： 分别吸取胆固醇标准储备液 （ ４．１６ ） ０．０ｍＬ 、 ２．０ｍＬ 、 ４．０ｍＬ 、 ６．０ｍＬ 、 ８．０ｍＬ 、 １０．０ｍＬ ， 用无水乙醇定容至 １０ｍＬ ， 该标准系列工作液的浓度分别为 ０．０ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．４ｍｇ ／ ｍＬ 、 ０．８ｍｇ ／ ｍＬ 、 １．２ｍｇ ／ ｍＬ 、 １．６ｍｇ ／ ｍＬ 、 ２．０ｍｇ ／ ｍＬ 。 现用现配 。 ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 天平 ： 感量为 ０．１ｍｇ 。 ５ ． ２ 　 匀浆机 。 ５ ． ３ 　 电热恒温水浴锅 。 ５ ． ４ 　 涡旋混匀器 。 ５ ． ５ 　 旋转蒸发仪 。 ５ ． ６ 　 分光光度计 。 ６ 　 样品 ６ ． １ 　 全蛋样品 取 ２ 个 ～ ３ 个样品 ， 鸽蛋等小蛋可适当增加样品数量 ， 去壳 ， 将全蛋于匀浆机充分混匀 ， 储于清洁容器中 ， 作为全蛋样品 。 ６ ． ２ 　 蛋黄样品 取 ２ 个 ～ ３ 个样品 ， 鸽蛋等小蛋可适当增加样品数量 ， 去壳和蛋清 ， 用滤纸吸干蛋黄表面的蛋清 ， 将蛋黄于匀浆机充分混匀 ， 储于清洁容器中 ， 作为蛋黄样品 。 ７ 　 试验步骤 ７ ． １ 　 胆固醇标准曲线的制作 分别取 ６０ μ Ｌ 胆固醇标准系列工作液 （ ４．１７ ） 和 ３．０ｍＬ 显色剂 （ ４．１５ ）， 混匀后置于 ３７℃ 水浴中反应 １５ｍｉｎ ， 取出冷却至室温 。 在波长 ５０５ｎｍ 处 ， 测定吸光度 。 以浓度为横坐标 ， 吸光度为纵坐标制作标准曲线 。 ７ ． ２ 　 皂化 称取 ２．００ｇ 全蛋样品或 １．００ｇ 蛋黄样品 ， 精确到 ０．１ｍｇ ， 于 ５０ｍＬ 烧杯中 ， 加入 １０ｍＬ 氢氧化钾溶 ２ 犌犅 ／ 犜 ３７０７７ — ２０１８ 液 （ ４．１０ ） 和 ２０ｍＬ 甲醇 ， 摇匀 ， ６５℃ 水浴保温 １ｈ 。 每隔 ２０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 振摇一次使皂化完全 。 ７ ． ３ 　 提取 皂化完毕取出烧杯 ， 冷却至室温 ， 加水 ２０ｍＬ ， 转移至 １２５ｍＬ 分液漏斗中 ， 用乙醚萃取三次 ， 每次 １５ｍＬ ， 振摇 ， 静置分层后 ， 收集三次乙醚萃取液于另一 １２５ｍＬ 分液漏斗中 ， 加入 ３ｍＬ 氯化钠溶液 （ ４．１１ ）， 水洗乙醚层至中性 。 ７ ． ４ 　 浓缩 将水洗后的乙醚萃取液转移至 １００ｍＬ 鸡心瓶中 ， ５０℃ 水浴旋转蒸发浓缩至近干 ， 用无水乙醇溶解并定容至 １０ｍＬ ， 作为待分析样液 。 ７ ． ５ 　 样品测定 取 ６０ μ Ｌ 待分析样液和 ３．０ｍＬ 显色剂 ， 混匀后置于 ３７℃ 水浴中反应 １５ｍｉｎ ， 取出冷却至室温 。 在波长 ５０５ｎｍ 处 ， 测定吸光度 。 不同样品的前处理需要同时做空白试验 。 ８ 　 试验数据处理 样品中胆固醇含量以质量分数 犡 计 ， 数值以毫克每 １００ 克 （ ｍｇ ／ １００ｇ ） 表示 ， 按式 （ １ ） 计算 ： 犡 ＝ ρ × 犞 × １００ 犿 ……………………（ １ ） 　　 式中 ： ρ ——— 由标准曲线查得或回归方程计算待分析样液中胆固醇浓度的准确数值 ， 单位为毫克每毫升 （ ｍｇ ／ ｍＬ ）； 犞 ——— 待分析样液定容体积的数值 （ 通常为 １０ｍＬ ）， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犿 ——— 样品质量的数值 ， 单位为克 （ ｇ ）。 计算结果表示到小数点后一位 。 ９ 　 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 １０％ 。 犌犅 ／ 犜 ３７０７７ — ２０１８