书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６７７５ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犘狊犲狌犱狅犮犲狉犮狅狊狆狅狉犪犪狀犵狅犾犲狀狊犻狊 犆狉狅狌狊牔犝．犅狉犪狌狀 ２０１８  ０９  １７ /G2D /G2E ２０１９  ０４  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国广东出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 冯黎霞 、 胡学难 、 左然玲 、 武目涛 、 王卫芳 、 赵立荣 、 于璇 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６７７５ — ２０１８ 柑橘斑点病菌检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了植物检疫中柑橘斑点病菌的检疫鉴定方法 。 本标准适用于柑橘属苗木和果实上柑橘斑点病菌的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ１５３８．１ 　 培养基制备指南 　 第 １ 部分 ： 实验室培养基制备质量保证通则 ３ 　 方法原理 柑橘斑点病菌分类 、 分布及寄主信息参见附录 Ａ 。 本标准以该病原菌寄主危害症状 、 形态学特征 、 培养特性作为主要检疫鉴定依据 ， 致病性测定作为柑橘斑点病菌的辅助检疫鉴定依据 。 ４ 　 设备用具 ４ ． １ 　 仪器设备 体视显微镜 、 生物显微镜 、 超净工作台 、 高压灭菌器 、 电子天平 （ 感量 ０．０１ｇ ）、 生物培养箱 。 ４ ． ２ 　 实验用具 标签 、 定性滤纸 、 样品袋 、 保鲜袋 、 手持放大镜 、 镊子 、 剪刀 、 解剖刀 、 酒精灯 、 载玻片 、 盖玻片 、 接种针 、 培养皿 、 烧杯 、 量筒 、 三角瓶 、 玻棒 、 微量移液器 （ 可调试范围 ２．５ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）、 ｐＨ 计 。 ５ 　 试剂和培养基 ５ ． １ 　 试剂 无水乙醇 、 ０．５％ 次氯酸钠 （ ＮａＯＣｌ ） 溶液 、 碳酸钙 （ ＣａＣＯ ３ ）、 无菌双蒸水 。 ５ ． ２ 　 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ）： 称取 ２００ｇ 马铃薯 ， １５ｇ 葡萄糖 ， １５ｇ 琼脂 。 马铃薯去皮切成小 块后加水煮沸 ２０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ ， 纱布过滤后加入 １５ｇ 琼脂 ， 溶化后加入 １５ｇ 葡萄糖 ， 去离子水补足 １０００ｍＬ ， 将培养基的 ｐＨ 值调至 ５．６ ， １２１℃ 灭菌 ２０ｍｉｎ 。 也可采用商品化 ＰＤＡ 粉按使用说明进行 配制 。 Ｖ８ 培养基 （ Ｖ８Ａ ）： １００ｍＬＶ８ 蔬菜汁 ， 碳酸钙 ０．２ｇ ， 琼脂粉 １５０ｇ ， 去离子水补足 １０００ｍＬ ， １２１℃ １ 犌犅 ／ 犜 ３６７７５ — ２０１８ 灭菌 ２０ｍｉｎ 。 配制培养基时 ， 遵循 ＳＮ ／ Ｔ１５３８．１ 的要求 。 ６ 　 检疫鉴定方法 ６ ． １ 　 现场查验 仔细检查植株或果实是否有附录 Ａ 中表述的危害症状 ， 采集的有疑似症状样品保存无菌透明塑料 袋中 ， 粘贴标签后冷藏保存 ， 以备进一步分离 。 ６ ． ２ 　 实验室鉴定 ６ ． ２ ． １ 　 直接镜检 如病枝或病果表面有明显病征 ， 可直接在体式显微镜下观察记录病斑的细微特征 ， 包括病斑的形 态 、 大小和颜色 。 挑取病部分生孢子梗 、 分生孢子制成玻片 ， 置于生物显微镜下镜检 ， 观察记录分生孢子 梗 、 分生孢子的颜色和形态特征 。 ６ ． ２ ． ２ 　 保湿培养 如病叶 、 病果和病枝上只有可疑病状而无明显病征 ， 则将病叶 、 病果或病枝 （ 截成 ５ｃｍ ） 置于样品袋 中 ， ２５℃ 保湿培养 ， 观察症状变化 。 ６ ． ２ ． ３ 　 分离培养 直接挑取病部的分生孢子梗或分生孢子团 ， 置于 ＰＤＡ 平板上 ； 或采用组织分离培养法 ， 用解剖刀 将病健交界组织切成 ４ｍｍ×４ｍｍ 进行表面消毒 ， ０．５％ＮａＯＣｌ 溶液浸泡 ５ｍｉｎ ， 无菌水冲洗 ３ 次 ， 最 后用无菌滤纸吸干表面水分 ， 放置于 ＰＤＡ 平板上 。 每个 ＰＤＡ 平板放置 ４ 块 ～ ６ 块样品组织 ， ２４℃ ～ ２８℃ 条件下保湿培养 。 培养 ５ｄ ～ ７ｄ ， 用无菌接种针从菌落边缘挑取菌丝块置于 Ｖ８ 培养基上进行纯 化培养 ３０ｄ ， 培养条件为 １２ｈ 光亮 ， １２ｈ 黑暗 。 定期观察记录菌落的形态 、 颜色 、 大小和质地 、 分生孢子 颜色和形态特征 ， 疑似菌株转到 ＰＤＡ 培养基上纯化 ３ 次 ， 保存备用 。 ６ ． ２ ． ４ 　 致病性测定 将纯分离物作为供试菌株用伤口接种法接种幼嫩新鲜柑橘果实 （ 果龄 １ 周 ～ ３ 周为佳 ）。 首先供试 菌株在 ＰＤＡ 平板上于 ２５℃ 条件下 １２ｈ 光亮 、 １２ｈ 黑暗培养 ３０ｄ ， 然后挑取菌落上的分生孢子 ， 用无菌 水制成孢子悬浮液 （ 孢子浓度为 ３．０×１０ ５ ／ ｍＬ ）。 用 ７０％ 乙醇对供试柑橘果实表面消毒 。 用无菌刀片 在果身切出 １ｃｍ ～ ２ｃｍ 宽度的圆环 ， 去掉果皮 ， 将 ２ｍＬ 孢子悬浮液注入伤口内 ， 无菌水做对照 ， 将无 菌湿润的滤纸盖在伤口处保湿 ， 放入样品袋中 ， 置于 ２５℃ 下保湿培养 。 每个菌株接种柑橘不少于 １０ 个 。 定期观察接种果实的发病情况 ， 发病后按照 ６．２．３ 方法分离病菌 ， 对病菌形态鉴定 。 ７ 　 鉴定特征 ７ ． １ 　 症状 叶片上具黄绿色病斑 ， 叶斑病菌两面生 ， 病斑直径 ４ｍｍ ～ １０ｍｍ 左右 ， 幼嫩叶片病斑常表现黄萎 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６７７５ — ２０１８ 坏死 ， 严重时 ， 叶片脱落 ； 果实病斑圆形至不规则形 ， 离散或联合 ， 最大直径可达 ３ｃｍ ～ ４ｃｍ ， 嫩果症状 常从增生产生瘤状病斑开始 ， 边缘有黄色晕圈 ， 成熟果实的病斑一般是平坦的 ， 病部木栓化 （ 症状图参见 附录 Ｂ 图 Ｂ．１ ）。 ７ ． ２ 　 菌落特征 在 Ｖ８ 培养基平板上 ２４℃ ～ ２８℃ 培养 ３０ｄ 后 ， 菌落平铺 ， 呈灰白色 ， 气生菌丝旺盛 ， 绒毛状 。 培养 后期 ， 从菌落中央开始变成灰橄榄色 ， 黑灰色至黑色 ， 逐渐菌落边缘菌丝体颜色也逐渐加深 ， 菌落中央隆 起 ， 质地逐渐变硬 ， 炭质 ， 表面凹凸不平 ， 菌落背面为深墨绿色 。 ７ ． ３ 　 病菌形态 分生孢子梗从气孔生出 ， 浅褐色至褐色 ， 具多个隔膜 ， 平滑 ， 宽 ３ μ ｍ ～ ７ μ ｍ ， 高 ２７ μ ｍ ～ ２４０ μ ｍ ， 分 生孢子梗单生 、 丛生或形成分散的宽的联丝体 ， 无分枝 ， 直径为 １２ μ ｍ ～ ４５ μ ｍ ， 通常从子座上长出 ， 子 座直径为 ３０ μ ｍ ～ ６０ μ ｍ 。 分生孢子顶生或顶侧生 ， 单生或 ２ 个 ～ ４ 个多孢链状生 ， 平滑 ， 透明至浅褐 色 ， 圆柱形或稍弯 ， 顶部圆形 ， 基部稍平钝至弧形弯曲 ， １ 个 ～ ６ 个 （ 通常 ３ 个 ～ ４ 个 ） 分隔 ， ２３ μ ｍ ～ ８７ μ ｍ 长 ， 分生孢子 ４ μ ｍ ～ ５ μ ｍ （ ４ μ ｍ ～ ６．５ μ ｍ ） 宽 ， 基部 ２ μ ｍ ～ ３ μ ｍ 宽 。 产孢细胞末端具轻微膝状 弯曲 ， 产孢位置具明显的孢痕疤 ， 但不增厚 （ 病菌形态特征图参见附录 Ｃ 图 Ｃ．１ ）。 ７ ． ４ 　 致病性测定 分离得到的病菌分离物得到柯赫氏法则验证 。 即以柑橘果实为接种材料 ， 利用 ６．２．４ 方法接种 ３０ｄ 后 ， 柑橘果实出现干腐 、 组织硬化等症状 。 从病部得到的分离物培养特征 、 形态特征与供试接种菌株 一致 。 ８ 　 结果判定 符合下列任一种情况均可判定为检出柑橘斑点病菌 ： 如果病部有明显的病状和病征 ， 进行分离培养后 ， 病菌形态学特征和菌落特征与 ７．１ 和 ７．２ 吻合 。 如果病部有病状但无病征 ， 经保湿培养和 （ 或 ） 分离培养所产生的病菌形态学特征和菌落特征与 ７．１ 、 ７．２ 吻合 ， 致病性测定结果符合 ７．４ 。 ９ 　 样品和资料的保存 ９ ． １ 　 样品的保存 检验为阳性的样品标注来源 、 寄主 、 分离时间 、 鉴定人后置于 ４℃ 冰箱保存 ； 病菌纯培养菌株在含 ２０％ 甘油的冻存管中 －８０℃ 保存 ， 或将菌株转接在 ＰＤＡ 斜面上培养 ， 待菌丝体长满斜面后 ， 置于 ４℃ 下保存 ， 并定期 （ 约 １８０ｄ ） 转管 。 对鉴定为柑橘斑点病菌的样品至少保存 ６ 个月 ， 以备复核谈判和仲裁 ， 样品保