ICS 65.020.30 CCS B 43 12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 1148—2022 绵羊胚胎移植技术规程 Technical regulations for embryo transfer of meat sheep 2022 - 09 - 08 发布 2022 - 10 - 14 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 1148—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由天津市农业农村委提出并归口。 本文件起草单位：天津市农业科学院。 本文件主要起草人：张金龙、张效生、郭晓飞、葛慎锋、李义海、冯婧、姚大为、李玉鹏、董春晓、 王彪、陈龙宾。 I DB12/T 1148—2022 绵羊胚胎移植技术规程 1 范围 本文件规定了绵羊胚胎移植技术中实验室准备、供体羊冲胚、检胚及胚胎质量鉴定、受体羊胚胎移 植等技术要求。 本文件适用于绵羊胚胎移植。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 816 肉羊饲养标准 DB12/T 137 肉用绵羊饲养管理技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 胚胎移植 embryo transfer 将一头母畜（供体）的受精卵取出，移植到另一头母畜（受体）体内，使之继续发育至分娩产仔。 3.2 供体羊 donor sheep 提供胚胎的母羊。 3.3 受体羊 receptor sheep 接受胚胎的母羊。 4 实验室准备 4.1 试剂、药品 参见附录A、附录B 4.2 设、耗材 参见附录C。 4.3 胚胎室要求 4.3.1 地面进行硬化、防滑处理，门窗密封、严紧、无尘。 4.3.2 室内顶部安装紫外线灯。 2 DB12/T 1148—2022 4.3.3 室内环境温度保持在 20℃～25℃，避免阳光直射。 5 供体羊冲胚 5.1 供体羊选择 5.1.1 供体羊谱系清楚、遗传稳定，品种优良、生产性能好； 5.1.2 体质健壮，年龄在 1 岁～4 岁； 5.2 供体羊饲养管理 保持稳定的饲养环境，避免应激，饲养符合DB12/T 137、NY/T 816规定。 5.3 同期发情 在母羊发情周期的任意一天放置孕酮栓，具体参见附录D。 5.4 超数排卵 母羊放置孕酮栓后第10天开始注射促卵泡素（FSH），2次/天，连续4天，具体见附录D。 5.5 发情鉴定 取出阴道栓后每隔8小时用公羊试情1次，以母羊站立接受公羊爬跨为母羊发情标准。 5.6 人工授精 5.6.1 母羊判定发情后 8 小时进行人工输精，输精两次，间隔 8 小时～12 小时。 7 5.6.2 输精量 0.2ml/只.次～0.4ml/只.次，每次输精有效精子数不少于 3.0×10 。 5.7 胚胎收集 5.7.1 胚胎收集时间， 参见附录D。 5.7.2 术前准备 供体羊在手术前12小时空腹、禁水。 5.7.3 供体羊手术 5.7.3.1 5.7.3.2 5.7.3.3 5.7.3.4 乳房前，腹部备皮，范围 20cm×20cm。备皮后用 5%碘酊棉球消毒，再用 75%酒精棉球脱碘。 供体羊仰卧保定于手术床上，肌肉注射麻醉，麻醉后,使手术床与地面成 45℃。 在乳房前 2cm～3cm，腹中线侧面做 5cm 的纵向切口，依次切开皮肤、肌肉和腹膜。 从切口处取出子宫角，记录卵巢黄体的数量。 5.7.4 冲胚 5.7.4.1 在子宫角大弯处用止血钳尖扎孔，将冲胚管插入，用注射器充气使冲卵管的气囊封闭一侧子 宫角，冲卵管的另一端接 90 ㎜平皿。 5.7.4.2 冲卵针从子宫角末端向子宫角大弯方向刺入，使冲卵针、子宫角和冲卵管形成通路。 5.7.4.3 用注射器吸 30ml 冲胚液注入冲卵针冲洗子宫角，将液体经过冲卵管回收至 90 ㎜培养皿中。 3 DB12/T 1148—2022 5.7.5 创口缝合 5.7.5.1 冲胚完成后，将子宫送回腹腔。 5.7.5.2 缝合创口，肌肉腹膜连续缝合、皮肤结节缝合，皮肤前创口撒消炎粉。 5.7.5.3 缝合完成后进行创面整理，碘酊消毒，注射抗生素和解麻药物，解除保定。 6 检胚及胚胎质量鉴定 6.1 检胚 6.1.1 在 35mm 的培养皿中注入胚胎保存液，放在恒温台上预热。 6.1.2 将收集到的冲胚液移至实体显微镜下，检出胚胎，移入 35mm 的培养皿中。 6.1.3 每个平皿在显微镜下重复检查 3 次，检出平皿中所有胚胎。 6.2 胚胎质量鉴定 6.2.1 胚胎发育阶段和质量鉴定，参见附录 E。 6.2.2 鉴定后的胚胎做好记录，包括羊号、胚胎发育阶段、质量等信息，见附录 F。 6.3 胚胎装管 6.3.1 在体视显微镜下，将鉴定后的胚胎装入胚胎移植枪中，准备移植。 6.3.2 胚胎装入移植枪按照三段液滴两段空气，胚胎液滴位于移植枪的中间段。 7 受体羊胚胎移植 7.1 受体羊选择 有正常的发情周期，无繁殖机能疾病，年龄在1胎以上的母羊。 7.2 受体羊饲养管理 受体羊组群加强饲养管理，保持环境相对稳定，避免应激，饲养符合DB12/ T 137、NY/T 816规定。 7.3 同期发情 受体羊同期发情方法，见附录D。 7.4 受体羊移植 7.4.1 受体羊在移植前 12 小时空腹，禁水。 7.4.2 术部备皮同步骤 5.7.2， 7.4.3 受体羊黄体观察： a) 手术法：参考供体羊手术 5.7.2，取出子宫和卵巢，观察黄体数量和颜色，进行记录； b) 腹腔内窥镜法：在受体羊乳房前 2cm～3cm 腹中线两侧做各做一个创口，通过腹腔内窥镜观察 黄体数量、大小和颜色，并取出有黄体测的子宫角，进行记录。 7.4.4 在子宫角细段扎孔，将装有胚胎的移植枪通过该孔导入子宫角，推出胚胎，将子宫角送回腹腔 内。 7.4.5 缝合创口，创口撒消炎粉，碘酊消毒，注射抗生素和解麻药物，解除保定。 7.4.6 受体移植记录包括受体羊号、移植时间、移植胚胎数和胚胎登记等信息，见附录 G。 4 DB12/T 1148—2022 7.4.7 移植胚胎后的受体羊，避免应激反应，饲养管理符合 DB12/T 137、NY/T 816 规定。 5 DB12/T 1148—2022 A A 附 录 A （资料性） 同期发情、超数排卵耗材 同期发情、超数排卵耗材见表A.1。 表A.1 同期发情、超数排卵耗材 序号 名称 用途 1 孕酮栓 供、受体羊同期发情 2 促卵泡素（FSH） 供体羊超数排卵 3 孕马血清促性腺激素（PMSG） 供、受体羊同期发情 4 促黄体素释放激素（LH） 供体羊同期排卵 5 冲胚液 子宫角冲胚 6 胚胎保存液（Holding） 胚胎体外保存 6 DB12/T 1148—2022 B B 附 录 B （资料性） 常规耗材 常规耗材见表B.1。 表B.1 常规耗材 序号 名称 用途 1 手术器械 1 套 供、受体羊手术 2 消炎粉 手术创口消炎 3 缝合线 手术创口缝合 4 冲卵管 子宫角冲胚 5 冲卵针 子宫角冲胚 6 胚胎移植枪 受体羊移植胚胎用 7 90mm 培养皿 收集冲胚液用 8 35mm 培养皿 胚胎保存和质量鉴定 9 75%酒精 手术部位消毒 10 碘酊 手术部位消毒 11 抗生素 供、受体羊手术后抗感染 7 DB12/T 1148—2022 C C 附 录 C （资料性） 胚胎移植设备 胚胎移植设备见表C.1。 表C.1 胚胎移植设备 序号 名称 用途 1 移动紫外灯 实验室消毒 2 水浴锅 生理盐水和冲胚液加热、保温 3 手术床 供、受体羊保定 4 生物显微镜 精子活力检查 5 腹腔内窥镜 输精和移植胚胎用 6 体视显微镜 检胚和胚胎质量鉴定 7 恒温台 胚胎恒温操作 8 DB12/T 1148—2022 D D 附 录 D （资料性） 绵羊胚胎移植方案 绵羊胚胎移植方案见表D.1。 表D.1 绵羊胚胎移植方案 序号 名称 用途 第0天 埋植孕酮栓 埋植孕酮栓 第 10 天 肌注 FSH 第 11 天 肌注 FSH 第 12 天 肌注 FSH 第 13 天 肌注 FSH，撤去孕酮栓 第 14 天 肌注 PMSG，人工输精 第 15 天 发情羊肌注促黄体素（LH）、人工输精 观察发情 第 21 天 胚胎收集 移植胚胎 撤去孕酮栓，肌注 PMSG 9 DB12/T 1148—2022 E E 附 录 E （资料性） 胚胎鉴定 E.1 胚胎的发育阶段鉴定： a) b) c) d) e) f) g) 桑椹胚：5 天～6 天，只能观察到球状细胞团，分不清分裂球，细胞团占据卵黄腔大部分； 致密桑椹胚：6 天～7 天，细胞团变小，占卵黄腔的 60%-70%； 早期囊胚：7 天～8 天，细胞团一部分出现光亮胚胞腔，细胞团占据 70%-80%，难以分清内细 胞团和滋养层； 囊胚：7 天～8 天，内细胞团和滋养层界限清晰，胚腔明显，细胞充满卵黄腔； 扩张囊胚：8 天～9 天，囊胚腔明显扩大，体积增大到原来的 1.5 倍，与透明带无间隙，透明 带变薄； 孵化胚：9 天～11 天，胚胞腔继续扩张，致使透明带破裂，卵细胞脱出； 凡在 6 推荐～8 天回收的 16 细胞以下的胚胎均列为非正常发育胚胎，不宜使用。 E.2 胚胎质量鉴定： a) b) c) A 级：胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球均匀，紧凑，色调、透明带适中，无附着细胞和液泡； B 级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着细胞和液泡，变性细胞占 10%～20%； C 级：轮廓不清晰，色调发暗，结构松散，游离细胞和液泡多，变性细胞占 20%～50%。 10 DB12/T 1148—2022 F F 附 录 F （资料性） 供体羊冲胚记录 供体羊冲胚记录见图F.1。 图F.1 供体羊冲胚记录 11 DB12/T 1148—2022 G G 附 录 G （资料性） 受体羊移植记录 受体羊移植记录见图G.1。 图G.1 受体羊移植记录 12