书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆犆犛犃 ４０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０９８０ — ２０２１ 生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狉犲犱狌犮犻狀犵狊狌犵犪狉犻狀犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾狆狉狅犱狌犮狋狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔狑犻狋犺狆狉犲犮狅犾狌犿狀犱犲狉犻狏犪狋犻狕犪狋犻狅狀 　 ２０２１  １１  ２６ 发布 ２０２２  ０６  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中国测试技术研究院生物研究所 、 深圳市分析测试协会 、 甘肃中商食品质量检验检测有限公司 、 西华大学 、 电子科技大学 、 青岛科技大学 、 中国测试技术研究院 。 本文件主要起草人 ： 刘明东 、 许洋 、 管驰 、 杨锐 、 陈鹏 、 黄玉坤 、 蒋子敬 、 周鑫魁 、 马丽侠 、 程玉华 、 钱滢文 、 吴微 、 杨杰 、 王力均 、 叶德萍 、 陈凯 、 张简 、 张永勤 、 洪霞 、 周李华 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０９８０ — ２０２１ 生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法 １ 　 范围 本文件规定了采用柱前衍生高效液相色谱法测定生化制品中 Ｄ 甘露糖 、 Ｄ 核糖 、 Ｌ 鼠李糖 、 Ｄ 半乳糖 、 Ｌ 阿拉伯醛糖 、 Ｄ 木糖 、 Ｌ 岩藻糖 、 Ｄ 葡萄糖 、 Ｄ 麦芽糖 、 Ｄ 乳糖 １０ 种还原糖的测定方法 。 本文件适用于含糖胃蛋白酶 、 静脉注射用人免疫球蛋白 、 狂犬病人免疫球蛋白 、 改良 Ｙ 培养基 、 葡萄糖肉汤培养基 、 缓冲动力  硝酸盐 、 木糖  明胶培养基等生化制品中的甘露糖 、 核糖 、 鼠李糖 、 半乳糖 、 阿拉伯糖 、 木糖 、 岩藻糖 、 葡萄糖 、 麦芽糖 、 乳糖含量测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 原理 样品中的还原糖经沸水提取 ， 提取液与 １ 苯基 ３ 甲基 ５ 吡唑啉酮 （ ＰＭＰ ） 在碱性条件下反应 ， 生成糖衍生物 ， 经液相色谱分离紫外检测器测定 ， 色谱保留时间定性 、 外标法定量 。 ５ 　 试剂或材料 除特殊说明外 ， 本方法所用试剂除流动相为色谱纯外均为分析纯 ， 试验用水均为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ５ ． １ 　 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ）。 ５ ． ２ 　 氢氧化钠 （ ＮａＯＨ ）。 ５ ． ３ 　 亚铁氰化钾 ［ Ｋ ４ Ｆｅ （ ＣＮ ） ６ · ３Ｈ ２ Ｏ ］。 ５ ． ４ 　 乙酸锌 ［ Ｚｎ （ ＣＨ ３ ＣＯＯ ） ２ · ２Ｈ ２ Ｏ ］。 ５ ． ５ 　 １ 苯基 ３ 甲基 ５ 吡唑啉酮 （ Ｃ １０ Ｈ １０ Ｎ ２ Ｏ ， ＰＭＰ ）。 ５ ． ６ 　 盐酸 （ ＨＣｌ ）。 ５ ． ７ 　 三氯甲烷 （ ＣＨＣｌ ３ ）。 ５ ． ８ 　 甲醇 （ ＣＨ ３ ＯＨ ）。 ５ ． ９ 　 乙腈 （ ＣＨ ３ ＣＮ ）： 色谱纯 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０９８０ — ２０２１ ５ ． １０ 　 三乙胺 （ Ｃ ６ Ｈ １５ Ｎ ）。 ５ ． １１ 　 正己烷 （ Ｃ ６ Ｈ ６ ）。 ５ ． １２ 　 亚铁氰化钾溶液 （ １０６ｇ ／ Ｌ ）： 称取 １０６．０ｇ 亚铁氰化钾 ， 用水溶解并稀释至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １３ 　 乙酸锌溶液 （ ２２０ｇ ／ Ｌ ）： 称取 ２２０．０ｇ 乙酸锌 ， 用水稀释至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １４ 　 ０．５ｍｏｌ ／ Ｌ１ 苯基 ３ 甲基 ５ 吡唑啉酮 （ ＰＭＰ ） 衍生溶液 ： 称取 ８７．１ｇＰＭＰ 衍生化试剂 ， 加甲醇溶解并定容至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １５ 　 １．０ｍｏｌ ／ ＬＮａＯＨ 溶液 ： 称取 ４０．０ｇ 氢氧化钠 ， 加入水中溶解并稀释至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １６ 　 １．０ｍｏｌ ／ ＬＨＣｌ 溶液 ： 取 ８３．２ｍＬ 浓盐酸 ， 缓慢加入约 ８００ｍＬ 水中 ， 冷却后加水定容至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １７ 　 糖标准品 ： Ｄ 甘露糖 （ ＣＡＳ ： ３４５８２８４ ）、 Ｄ 核糖 （ ＣＡＳ ： ５０６９１ ）、 Ｌ 鼠李糖 （ ＣＡＳ ： １００３０８５０ ）、 Ｄ 半乳糖 （ ＣＡＳ ： ５９２３４ ）、 Ｌ 阿拉伯醛糖 （ ＣＡＳ ： ５３２８３７０ ）、 Ｄ 木糖 （ ＣＡＳ ： ３１１７８７０８ ）、 Ｌ 岩藻糖 （ ＣＡＳ ： ２４３８８０４ ）、 Ｄ 葡萄糖 （ ＣＡＳ ： ５０９９７ ）、 Ｄ 麦芽糖 （ ＣＡＳ ： ３４５８２８４ ）、 Ｄ 乳糖 （ ＣＡＳ ： ６３４２３ ）， 纯度均 ≥ ９９％ 。 ５ ． １８ 　 混合标准储备液 ： 分别称取 １００ｍｇ 标准物质 （ 精确至 ０．１ｍｇ ）， 用水溶解并定容至 １００ｍＬ ， 配制成质量浓度约为 １０００ μ ｇ ／ ｍＬ 的混合标准储备液 ， 冷藏保存 。 ５ ． １９ 　 标准工作溶液的配制 ： 分别取 ０．０５ｍＬ 、 ０．１０ｍＬ 、 ０．２０ｍＬ 、 ０．５ｍＬ 、 １ｍＬ 、 ２ｍＬ 混合标准储备液定容至 １０ｍＬ 容量瓶 ， 配制成 ５ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ５０ μ ｇ ／ ｍＬ 、 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 和 ２００ μ ｇ ／ ｍＬ 标准溶液浓度系列 。 ５ ． ２０ 　 微孔过滤膜 ： 孔径 ０．４５ μ ｍ 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配紫外检测器 （ ＵＶ ） 或二极管阵列检测器 （ ＤＡＤ ）。 ６ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．０１ｍｇ 和 ０．０００１ｇ 。 ６ ． ３ 　 超声波提取器 ： 功率 ２５０Ｗ ， 工作频率 ４０ｋＨｚ 。 ６ ． ４ 　 离心机 ： 最大转速 １５０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ６ ． ５ 　 酸度计 ： 精度为 ０．０１ 个 ｐＨ 单位 ， ｐＨ 值测定范围为 ０ ～ １４ 。 ６ ． ６ 　 数显恒温水浴锅 ： 精确度到 ０．１℃ 。 ６ ． ７ 　 涡旋混匀器 。 ６ ． ８ 　 电动粉碎机 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 样品制备 取有代表性的样品至少 ５０ｇ ， 固体样品 （ 液体样品混匀直接待用 ） 用电动粉碎机粉碎 （ 过孔径为 ０．３ｍｍ 的筛 ）， 混匀后装入洁净的盛样容器内 ， 作为试样 ， 室温密封储存 。 ７ ． ２ 　 样品前处理 ７ ． ２ ． １ 　 固体样品前处理 称取样品 ５ｇ （ 精确到 ０．００１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加入 ２０ｍＬ 水 ， 在沸水浴中提取 ３０ｍｉｎ ， 超声提取 １０ｍｉｎ ； 样液泠却后 ， 加入正己烷 ５ｍＬ ， 涡旋 ２ｍｉｎ ， 于 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 弃去正己烷层 ， 将水层清液倒入 ５０ｍＬ 容量瓶中 ； 向固体残渣中加入 １０ｍＬ 水 ， 涡旋 ２ｍｉｎ ， 于 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ ， 水 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０９８０ — ２０２１ 层合并于上述 ５０ｍＬ 容量瓶中 ， 加入 ５ｍＬ 亚铁氰化钾溶液 ， ５ｍＬ 乙酸锌溶液 ， 用水定容 ， 混匀 ， 离心取上清液 ， 经 ０．４５ｍ 滤膜过滤后待用 。 ７ ． ２ ． ２ 　 含油脂及蛋白类液体样品前处理 称取样品 ５ｇ （ 精确到 ０．００１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加入 ２０ｍＬ 水 ， 在沸水浴中提取 １５ｍｉｎ ， 超声提取 １０ｍｉｎ ， 样液冷却后 ， 加入 ３ｍＬ 亚铁氰化钾溶液 ， ３ｍＬ 乙酸锌溶液 ， 用水定容至 ４０ｍＬ ， 充分振摇离心管 ， 于 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ； 取部分澄清水层 ， 加入正己烷 ５ｍＬ ， 振摇或涡旋 ２ｍｉｎ ， 于 ５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 。 取水层清液 ， 经 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤后待用 。 ７ ． ２ ． ３ 　 不含油脂及蛋白类液体样品前处理 称取样品 ５ｇ （ 精确到 ０．００１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 离心管中 ， 加水至 ４０ｍＬ ， 在沸水浴中提取 １５ｍｉｎ ， 超声提取 １０ｍｉｎ ， 样液泠却后 ， 转移至 ５０ｍＬ 容量瓶中定容 ， 取水层清液经 ０．４５ μ ｍ 滤膜过滤后待用 。 ７ ． ３ 　 试样衍生 分别吸取试样和不同浓度的标准工作溶液 ０．４ｍＬ 于 １５ｍＬ 具塞试管中 ， 加入 １．０ｍｏｌ ／ ＬＮａＯＨ 溶液 ０．２ｍＬ ， ０．５ｍｏｌ ／ ＬＰＭＰ