书 书 书犐犆犛 ６５ ． １２０ 犆犆犛犅 ４６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０８５０ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犕犲狋犺狅犱犳狅狉狋犺犲犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮犲犪犲犻狀犳犲犲犱 ２０２１  １０  １１ /G2D /G2E ２０２２  ０５  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ７６ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 江苏海企长城股份有限公司 、 中华人民共和国淮安海关 、 中华人民共和国南京海关 、 淮阴师范学院 。 本文件主要起草人 ： 王远见 、 何健 、 宦海霞 、 冯民 、 刘尧 、 蒋原 、 任盈盈 、 高旭 、 朱海燕 、 柯家法 、 张扬 、 张科 、 颜智勇 、 张敬友 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０８５０ — ２０２１ 饲料中肠杆菌科的检验方法 １ 　 范围 本文件描述了饲料中肠杆菌科检验的平板计数法和 ＭＰＮ 计数法 。 本文件适用于对饲料 （ 含宠物饲料 ） 的检验 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文 件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于 本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 肠杆菌科 　 犈狀狋犲狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮犲犪犲 在给定条件下发酵葡萄糖产酸 、 氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌 。 ３ ． ２ 最可能数 　 犿狅狊狋狆狉狅犫犪犫犾犲狀狌犿犫犲狉 基于泊松分布间接计数方法得到的数值 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＢＰＷ ： 缓冲蛋白胨水 （ ＢｕｆｆｅｒｅｄＰｅｐｔｏｎｅＷａｔｅｒ ） ＣＦＵ ： 菌落形成单位 （ ＣｏｌｏｎｙＦｏｒｍｉｎｇＵｎｉｔｓ ） ＥＥ ： 肠道菌增菌 （ ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ） ＭＰＮ ： 最可能数 （ ＭｏｓｔＰｒｏｂａｂｌｅＮｕｍｂｅｒ ） ＮＡ ： 营养琼脂 （ ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ ） ＶＲＢＧＡ ： 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂 （ ＶｉｏｌｅｔＲｅｄＢｉｌｅＧｌｕｃｏｓｅＡｇａｒ ） ５ 　 培养基或试剂 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂 。 ５ ． １ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 三级 。 ５ ． ２ 　 ＢＰＷ ： 按照附录 Ａ 中 Ａ．１ 执行 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０８５０ — ２０２１ ５ ． ３ 　 ＥＥ 肉汤 ： 按照 Ａ．２ 执行 。 ５ ． ４ 　 ＶＲＢＧＡ ： 按照 Ａ．３ 执行 。 ５ ． ５ 　 ＮＡ 平板 ： 按照 Ａ．４ 执行 。 ５ ． ６ 　 葡萄糖琼脂 ： 按照 Ａ．５ 执行 。 ５ ． ７ 　 革兰氏染色液 ： 按照 Ａ．６ 执行 。 ５ ． ８ 　 氧化酶试剂 ： 按照 Ａ．７ 执行 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 恒温培养箱 ： ３６℃±１℃ 。 ６ ． ２ 　 水浴箱 ： ４６℃±１℃ 。 ６ ． ３ 　 均质机 。 ６ ． ４ 　 拍打式均质器 。 ６ ． ５ 　 振荡器 。 ６ ． ６ 　 电子天平 ： 感量 ０．１ｇ 。 ６ ． ７ 　 显微镜 ： １０ 倍 ～ １００ 倍 。 ６ ． ８ 　 无菌培养皿 ： 直径 ９０ｍｍ 。 ６ ． ９ 　 无菌吸管 ： １ｍＬ （ ０．０１ｍＬ 刻度 ）、 １０ｍＬ （ ０．１ｍＬ 刻度 ） 或微量移液器及吸头 。 ６ ． １０ 　 试管 ： １８ｍｍ×１８０ｍｍ 、 １５ｍｍ×１５０ｍｍ 。 ６ ． １１ 　 无菌锥形瓶或等效容器 ： １５０ｍＬ 、 ５００ｍＬ 。 ６ ． １２ 　 均质袋 、 均质杯 。 ６ ． １３ 　 ｐＨ 计或精密 ｐＨ 试纸 。 ７ 　 取样 取样制样遵循随机性 、 代表性的原则 ， 采用无菌操作程序 ， 样品数量不少于 ５００ｇ （ ｍＬ ）， 需要混合均 匀 。 应在接近原有贮存温度条件下贮存试样 ， 并尽快完成检验 。 ８ 　 平板计数法 ８ ． １ 　 检验流程关键控制环节 平板计数法检验流程关键控制环节按照图 １ 进行 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０８５０ — ２０２１ 图 １ 　 平板计数法检验流程关键控制环节 ８ ． ２ 　 试验步骤 ８ ． ２ ． １ 　 试样处理 ８ ． ２ ． １ ． １ 　 易粉碎固体试样 ： 称取 ２５ｇ 试样 ， 放入盛有 ２２５ｍＬＢＰＷ 的无菌均质杯中 ， ８０００ｒ ／ ｍｉｎ ～ １００００ｒ ／ ｍｉｎ 均质 １ｍｉｎ ～ ２ｍｉｎ ； 或放入盛有 ２２５ｍＬＢＰＷ 的无菌均质袋中 ， 置于拍打式均质器中拍 打 １ｍｉｎ ～ ２ｍｉｎ ， 制成 １０ 倍稀释的试样匀液 。 ８ ． ２ ． １ ． ２ 　 不易粉碎固体试样 ： 称取 ２５ｇ 以上的试样 ， 装于均质袋中 ， 按照 １∶９ 比例加入适量 ＢＰＷ ， 置于 拍打式均质器中拍打 １ｍｉｎ ～ ２ｍｉｎ ， 制成 １０ 倍稀释的试样匀液 。 ８ ． ２ ． １ ． ３ 　 液体试样 ： 用无菌吸管吸取 ２５ｍＬ 试样放入盛有 ２２５ｍＬＢＰＷ 无菌锥形瓶 （ 瓶内预置适当数 量的无菌玻璃珠 ） 或其他无菌容器中 ， 置于振荡器中振荡 ， 充分混匀 ， 制成 １０ 倍稀释的试样匀液 。 ８ ． ２ ． １ ． ４ 　 用 １ｍＬ 无菌吸管或微量移液器吸取 １０ 倍稀释的试样匀液 １ｍＬ ， 沿管壁缓缓注入盛有 ９ｍＬ ＢＰＷ 的无菌试管中 （ 注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面 ）， 振摇试管或换用 １ 支 １ｍＬ 无菌吸管反 复吹打 ， 使其混合均匀 ， 制成 １００ 倍稀释的试样匀液 。 ８ ． ２ ． １ ． ５ 　 根据对试样污染状况的估计 ， 按照上述操作 ， 依次制成 １０ 倍递增系列稀释试样匀液 。 每递增 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０８５０ — ２０２１ 稀释 １ 次 ， 换用 １ 支 １ｍＬ 无菌吸管或吸头 。 从制备试样匀液至试样接种完毕 ， 全过程不得超过 １５ｍｉｎ 。 ８ ． ２ ． ２ 　 接种和培养 ８ ． ２ ． ２ ． １ 　 根据试样的污染情况及不同种类饲料中肠杆菌科的限量要求 ， 选择 ２ ～ ３ 个适宜的连续稀释度的试样匀液 １ｍＬ 加入到无菌培养皿中 ， 每个稀释度接种 ２ 个无菌培养皿 。 同时 ， 分别吸取 １ｍＬＢＰＷ 加入 ２ 个无菌培养皿中做空白对照 。 ８ ． ２ ． ２ ． ２ 　 将约 １０ｍＬ ～ １５ｍＬ 冷却至 ４６℃ 的 ＶＲＢＧＡ （ 可放置于 ４６℃±１℃ 恒温水浴箱中保温 ） 倾注于培养皿中 。 小心旋转培养皿 ， 使试样匀液与培养基充分混匀 。 ８ ． ２ ． ２ ． ３ 　 待琼脂凝固后 ， 再向其中倾注约 ５ｍＬ 的 ＶＲＢＧＡ 培养基覆盖平板表层 ， 以防止蔓延生长并使菌落特征更为明显 。 ８ ． ２ ． ２ ． ４ 　 待培养皿中的培养基凝固后 ， 翻转培养皿 ， 置于 ３６℃±１℃ 培养 １８ｈ ～ ２４ｈ 。 ８ ． ２ ． ３ 　 菌落计数和确认 ８ ． ２ ． ３ ． １ 　 肠杆菌科典型菌落为粉红色至红色或紫色菌落 ， 菌落计数以 ＣＦＵ 表示 。 选取典型菌落数在 １５ＣＦＵ ～ １５０ＣＦＵ 之间 、 无蔓延菌落生长的平板 ， 只计数典型菌落数 。 ８ ． ２ ． ３ ． ２ 　 其中一个平板有较大片状菌落生长时 ， 则不宜采用 ， 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数 ； 若片状菌落不到平板的一半 ， 而其余一半中菌落分布又很均匀 ， 则计算半个平板后乘以 ２ ， 代表一个平板菌落数 。 ８ ． ２ ． ３ ． ３ 　 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时 ， 则将每条单链作为一个菌落计数 。 ８ ． ２ ． ３ ． ４ 　 从每个平板上至少挑取 ５ 个 （ 小于 ５ 个则全选 ） 典型菌落进行确认 ； 如果有不同形态的典型菌落 ， 则每种形态分别至少挑取 １ 个菌落进行确认 。 ８ ． ２ ． ３ ． ５ 　 分别将所挑选的每一个菌落 ， 划线于 ＮＡ 平板 ， ３６℃±１℃ 培养 １８ｈ ～ ２４ｈ ， 挑取平板上的菌落进行典型菌落的确认 ： ａ ） 　 革兰氏染色试验 ： 将涂片在火焰上固定 ， 滴加结晶紫染色液 ， 染 １ｍｉｎ ， 水洗 ； 滴加革兰氏碘液 ， 作用 １ｍｉｎ ， 水洗 ； 滴加 ９５％ 乙醇脱色 １５ｓ ～ ３０ｓ ， 直至染色液被洗掉 ， 但不要过分脱色 、 水洗 ； 加沙黄复染液 ， 复染 １ｍｉｎ ， 水洗 、 干燥