书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆犆犛犃 ４０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０２６７ — ２０２１ 植物源产品中左旋多巴的测定高效液相色谱法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犔犲狏狅犱狅狆犪犻狀狆犾犪狀狋犱犲狉犻狏犲犱狆狉狅犱狌犮狋狊 — 犎犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ２０２１  ０５  ２１ 发布 ２０２１  １２  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中国测试技术研究院生物研究所 、 四川大学 、 甘肃中商食品质量检验检测有限公司 、 上海市计量测试技术研究院 、 深圳市计量质量检测研究院 、 中国计量大学 、 四川赛纳斯分析检测有限公司 、 甘肃省商业科技研究所有限公司 。 本文件主要起草人 ： 李怀平 、 冯德建 、 宋航 、 吴微 、 周婕 、 张协光 、 叶子弘 、 许洋 、 洪霞 、 赵爱平 、 许俊妹 、 史谢飞 、 周李华 、 周鑫魁 、 张雅芬 、 贾艳玲 、 夏文强 、 柴宗龙 、 罗进 、 马丽侠 、 杨国武 、 冯玉升 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０２６７ — ２０２１ 植物源产品中左旋多巴的测定高效液相色谱法 １ 　 范围 本文件描述了植物源产品中左旋多巴含量的高效液相色谱测定方法 。 本文件适用于蚕豆 （ 犞犻犮犻犪犳犪犫犪 Ｌ． ）、 狗爪豆 ［ 犛狋犻狕狅犾狅犫犻狌犿犮狅犮犺犻狀犮犺犻狀犲狀狊犻狊 （ Ｌｏｕｒ． ） ＴａｎｇｅｔＷａｎｇ ］、 常春油麻藤 （ 犕狌犮狌狀犪狊犲犿狆犲狉狏犻狉犲狀狊 Ｈｅｍｓｌ． ） 等植物源干样品中左旋多巴含量的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文 件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于 本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 原理 试样用 ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液超声提取后 ， 经反相色谱柱分离 ， 紫外 （ 或二极管阵列 ） 检测器检 测 ， 以保留时间定性 ， 采用外标法定量 。 ５ 　 试剂或材料 ５ ． １ 　 试剂 除非另有说明 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ５ ． １ ． １ 　 磷酸氢二钾 （ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ · ３Ｈ ２ Ｏ ）： 优级纯 。 ５ ． １ ． ２ 　 盐酸 （ ＨＣｌ ）。 ５ ． １ ． ３ 　 磷酸 （ Ｈ ３ ＰＯ ４ ）。 ５ ． １ ． ４ 　 甲醇 （ ＣＨ ３ ＯＨ ）： 色谱纯 。 ５ ． ２ 　 溶液配制 ５ ． ２ ． １ 　 ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液 ： 取盐酸 ２０ｍＬ ， 加水至 １Ｌ 。 ５ ． ２ ． ２ 　 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸氢二钾溶液 ： 称取磷酸氢二钾 ２．３ｇ ， 加水 ９５０ｍＬ 溶解 ， 加磷酸调节 ｐＨ７．０ ， 再 用水稀释至 １Ｌ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０２６７ — ２０２１ ５ ． ３ 　 标准品 左旋多巴标准品 ： 纯度 ≥ ９９％ ； 分子式 ： Ｃ ９ Ｈ １１ ＮＯ ４ ； ＣＡＳ 号 ： ５９９２７ 。 ５ ． ４ 　 标准溶液配制 ５ ． ４ ． １ 　 标准储备液 ： 称取左旋多巴标准品约 ２０ｍｇ （ 精确至 ０．１ｍｇ ）， 用 ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液溶解并 定容至 １０ｍＬ ， 配制成质量浓度为 ２０００ｍｇ ／ Ｌ 的左旋多巴标准储备液 ， 于 ４℃ 下保存备用 ， 有效期为 １ 个月 。 ５ ． ４ ． ２ 　 标准中间液 ： 准确移取标准储备液 ２．５ｍＬ 于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用 ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液稀 释定容 ， 摇匀 ， 配制成质量浓度为 ５０．０ｍｇ ／ Ｌ 的标准中间液 。 ５ ． ４ ． ３ 　 低浓度标准工作溶液 ： 分别准确移取适量标准中间液 ， 用 ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液稀释配制成质 量浓度为 ０．５００ｍｇ ／ Ｌ 、 １．２５ｍｇ ／ Ｌ 、 ２．５０ｍｇ ／ Ｌ 、 ５．００ｍｇ ／ Ｌ 、 １０．０ｍｇ ／ Ｌ 、 １５．０ｍｇ ／ Ｌ 、 ３０．０ｍｇ ／ Ｌ 的低浓 度标准工作溶液 ， 现配现用 。 ５ ． ４ ． ４ 　 高浓度标准工作溶液 ： 分别准确移取适量标准储备液 ， 用 ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液稀释配制成质 量浓度为 ３０．０ｍｇ ／ Ｌ 、 ５０．０ｍｇ ／ Ｌ 、 １００ｍｇ ／ Ｌ 、 ２００ｍｇ ／ Ｌ 、 ５００ｍｇ ／ Ｌ 、 ７００ｍｇ ／ Ｌ 、 １０００ｍｇ ／ Ｌ 的高浓度标 准工作溶液 ， 现配现用 。 ５ ． ５ 　 材料 微孔滤膜 （ 水相 ）： 孔径 ０．４５ μ ｍ 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 高效液相色谱仪 ： 配紫外检测器 （ ＵＶ ） 或二极管阵列检测器 （ ＤＡＤ ）。 ６ ． ２ 　 分析天平 ： 感量 ０．０１ｍｇ 和 ０．０００１ｇ 。 ６ ． ３ 　 超声波发生器 ： 功率 ２５０Ｗ ， 工作频率 ４０ｋＨｚ 。 ６ ． ４ 　 离心机 ： 转速不低于 ８０００ 犵 。 ６ ． ５ 　 酸度计 ： 精度为 ０．０１ 个 ｐＨ 单位 。 ６ ． ６ 　 涡旋混匀器 。 ６ ． ７ 　 电动粉碎机 。 ７ 　 样品 取蚕豆 、 狗爪豆 、 常春油麻藤等样品约 ２５０ｇ ， 用电动粉碎机粉碎 ， 过 ３５５ μ ｍ±１３ μ ｍ 内径筛 ， 混匀 制备好的试样均分成两份 ， 装入洁净的盛样容器内 ， 密封并标识 ， 于室温 、 密封 、 避光保存 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 试样处理 称取试样 １ｇ （ 精确至 ０．００１ｇ ） 于 ５０ｍＬ 具塞离心管中 ， 加入 １０ｍＬ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液 ， 涡旋 混匀后超声提取 ３０ｍｉｎ ， 间隔 １５ｍｉｎ 摇匀一次 ， 然后在 ８０００ （ × 犵 ） 下离心 ５ｍｉｎ ， 将上清液转移至 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０２６７ — ２０２１ ２５ｍＬ 容量瓶中 。 残渣再用 １０ｍＬ２％ （ 体积分数 ） 盐酸溶液重复提取一次 ， 合并两次提取液 ， 用 ２％ （ 体 积分数 ） 盐酸溶液定容 ， 摇匀 ， 过 ０．４５ μ ｍ 微孔滤膜 ， 待测 。 ８ ． ２ 　 测定 ８ ． ２ ． １ 　 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下所示 ： ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ １８ 色谱柱 ， ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ ， 粒径 ５ μ ｍ ， 或性能相当者 ； ｂ ） 流动相 ： 甲醇 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸氢二钾溶液 ＝５∶９５ ； ｃ ） 流量 ： ０．７ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｄ ） 柱温 ： ２０℃ ； ｅ ） 进样量 ： １０ μ Ｌ ； ｆ ） 检测波长 ： ２８０ｎｍ 。 ８ ． ２ ． ２ 　 标准工作曲线的制作 依据试样中左旋多巴的含量选择合适质量浓度范围的标准工作溶液由低到高浓度依次进样分析 ， 以左旋多巴色谱峰面积为纵坐标 ， 溶液质量浓度为横坐标 ， 绘制标准工作曲线 。 标准工作溶液色谱图见 附录 Ａ 中图 Ａ．１ 。 ８ ． ２ ． ３ 　 样品测定 将试样溶液注入高效液相色谱仪 ， 依据保留时间定性 ， 记录峰面积 ， 根据标准工作曲线得到试样溶 液中左旋多巴的质量浓度 ， 应使试样溶液中左旋多巴的质量浓度在标准工作曲线质量浓度范围内 ， 超过 标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样分析 。 典型样品溶液色谱图见图 Ａ．２ 。 ８ ． ３ 　 平行试验 按 ８．１ 和 ８．２ 的规定对同一试样进行两次平行测定 。 ９ 　 试验数据处理 试样中左旋多巴的含量按照式 （ １ ） 计算 ： 狑 ＝ ρ × 犞 × 犳 ×１０ －６ ×１００ 犿 …………………………（ １ ） 式中 ： 狑 ——— 试样中左旋多巴含量 ， 单位为克每百克 （ ｇ ／ １００ｇ ）； ρ ——— 由标准工作曲线得到的试样中左旋多巴质量浓度 ， 单位为毫克每升 （ ｍｇ ／ Ｌ ）； 犞 ——— 试样定容体积 ， 单位为毫升 （ ｍＬ ）； 犳 ——— 试样溶液稀释倍数 ； 犿 ——— 试样称样量 ， 单位为克 （ ｇ ）。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示 ， 结果保留三位有效数字 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０２６７ — ２０２１ １０ 　 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 １０％ 。 １１ 　 其他 本方法测定左旋多巴的检出限为 ０．０００２７５ｇ ／ １００ｇ ， 定量限为 ０．００１１０ｇ ／ １００ｇ 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ４０２６７ — ２０２１ 附 　 录 　 犃 （ 资料性 ） 高效液相色谱图 左旋多巴的标准工作溶液色谱图见图 Ａ．１ ， 典型样品溶液色谱图见图 Ａ．２ 。 图 犃 ． １ 　 左旋多巴标准工作溶液色谱图 图 犃