书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犆犆犛犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０２５７ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 　 犚犜犘犆犚 /G2A /G2B /G2C 犆狅犱犲狅犳犱犻犪犵狀狅狊犻狊犳狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狀狑犻狋犺狋犪狌狉犪狊狔狀犱狉狅犿犲狏犻狉狌狊 — 犚犜犘犆犚犿犲狋犺狅犱 ２０２１  ０５  ２１ /G2D /G2E ２０２１  １２  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。 本文件由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、 全国水产技术推广总站 。 本文件主要起草人 ： 万晓媛 、 杨冰 、 黄 絰 、 李清 、 史成银 、 张锋 、 宋晓玲 、 余卫忠 、 张庆利 、 李晨 、 许华 、 刘莉 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０２５７ — ２０２１ 桃拉综合征诊断规程 　 犚犜犘犆犚 检测法 １ 　 范围 本文件规定了桃拉综合征诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求 ， 针对桃拉综合征病毒 （ ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ， ＴＳＶ ）， 给出了 ＲＴＰＣＲ 检测法所需试剂或材料 、 仪器设备 、 样品 、 试验步骤和结果判定 。 本文件适用于对虾各生活期样品中 ＴＳＶ 带毒情况的定性检测 ， 以进行桃拉综合征的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ２８６３０．４ — ２０１２ 　 白斑综合征 （ ＷＳＤ ） 诊断规程 　 第 ４ 部分 ： 组织病理学诊断法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ｂｐ ： 碱基对 （ ｂａｓｅｐａｉｒ ） ｃＤＮＡ ： 互补脱氧核糖核酸 （ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ ） ＤＥＰＣ ： 焦碳酸二乙酯 （ ｄｉｅｔｈｙｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ｄＮＴＰｓ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＢ ： 溴化乙锭 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＭＭＬＶ ： 莫洛尼鼠白血病病毒 （ ｍｏｌｏｎｅｙｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉｎｖｉｒｕｓ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录  聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） 犜犪狇 ： 水生栖热菌 （ ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ ） Ｔｒｉｓ ： 三羟甲基氨基甲烷 （ ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ） ＴＳＶ ： 桃拉综合征病毒 （ ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ ） １ 犌犅 ／ 犜 ４０２５７ — ２０２１ ５ 　 试剂或材料 ５ ． １ 　 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ５ ． ２ 　 ＤＥＰＣ 处理水 ： 生化试剂 。 ５ ． ３ 　 ＴＲＩｚｏｌ ＴＭ 总 ＲＮＡ 提取试剂 ： 生化试剂 ， 或其他等效产品 。 ５ ． ４ 　 氯仿 。 ５ ． ５ 　 异丙醇 。 ５ ． ６ 　 无水乙醇 。 ５ ． ７ 　 无 ＲＮＡ 酶的 ７５％ 乙醇 ： 按附录 Ａ 中 Ａ．１ 配制 。 ５ ． ８ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 （ ＲＮａｓｉｎ 或 ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ， ４０Ｕ ／ μ Ｌ ）： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． ９ 　 ＭＭＬＶ 逆转录酶 （ ２００Ｕ ／ μ Ｌ ）： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １０ 　 ５×ＭＭＬＶ 逆转录酶缓冲液 ： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １１ 　 ｄＮＴＰｓ （ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 生化试剂 ， 含 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的混合物 ， －２０℃ 保存 ， 用于逆转录 。 ５ ． １２ 　 ｄＮＴＰｓ （ 各 ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 生化试剂 ， 含 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 各 ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的混合物 ， －２０℃ 保存 ， 用于 ＰＣＲ 。 ５ ． １３ 　 １０×ＰＣＲ 缓冲液 ： 生化试剂 ， 无 Ｍｇ ２＋ 离子 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １４ 　 ＭｇＣｌ ２ （ ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １５ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ ５Ｕ ／ μ Ｌ ）： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １６ 　 引物 ９９９２Ｆ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）： ５′ＡＡＧＴＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴ３′ 。 ５ ． １７ 　 引物 ９１９５Ｒ （ １０ｍｏｌ ／ Ｌ ）： ５′ＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ３′ 。 ５ ． １８ 　 ＲＴＰＣＲ 检测阳性对照 ： 已知受 ＴＳＶ 感染且 ＲＴＰＣＲ 结果显示阳性的对虾组织样品 ， －８０℃ 保存 。 ５ ． １９ 　 ＲＴＰＣＲ 检测阴性对照 ： 已知未受 ＴＳＶ 感染且 ＲＴＰＣＲ 结果显示阴性的对虾组织样品 ， －８０℃ 保存 。 ５ ． ２０ 　 ＲＴＰＣＲ 检测空白对照 ： ＤＥＰＣ 处理水 。 ５ ． ２１ 　 ５０× 电泳缓冲液 ： 按 Ａ．２ 配制 。 ５ ． ２２ 　 １× 电泳缓冲液 ： 按 Ａ．３ 配制 。 ５ ． ２３ 　 琼脂糖 ： 生化试剂 。 ５ ． ２４ 　 ＤＮＡ 分子量标准 ： 生化试剂 。 ５ ． ２５ 　 ６× 载样缓冲液 ： 生化试剂 。 ５ ． ２６ 　 １０ｍｇ ／ ｍＬＥＢ 贮存液 ： 按 Ａ．４ 配制 ， 或其他等效产品 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 ＰＣＲ 仪 。 ６ ． ２ 　 电泳仪 。 ６ ． ３ 　 水平电泳槽 。 ６ ． ４ 　 紫外观察仪或凝胶成像仪 。 ６ ． ５ 　 高速冷冻离心机 。 ６ ． ６ 　 水浴锅或金属浴 。 ６ ． ７ 　 普通冰箱 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０２５７ — ２０２１ ６ ． ８ 　 －８０℃ 超低温冰箱 。 ６ ． ９ 　 电炉或微波炉等其他加热设备 。 ６ ． １０ 　 微量移液器 ： 量程 ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ ～ ２０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００Ｌ 。 ７ 　 样品 ７ ． １ 　 采样对象 凡纳滨对虾 （ 犔犻狋狅狆犲狀犪犲狌狊狏犪狀狀犪犿犲犻 ） 和细角滨对虾 （ 犔 ． 狊狋狔犾犻狉狅狊狋狉犻狊 ） 等易感对虾 。 参见附录 Ｂ 。 ７ ． ２ 　 采样数量 、 方法和保存运输 采样数量 、 方法和保存运输应符合 ＧＢ ／ Ｔ２８６３０．４ — ２０１２ 中附录 Ｂ 的要求 。 ７ ． ３ 　 样品的采集 ７ ． ３ ． １ 　 对虾仔虾取完整个体 ； 幼虾至成虾阶段取去除眼柄的头胸甲 （ 淋巴器官 、 鳃丝 、 触角腺等 ） 和附肢 。 ７ ． ３ ． ２ 　 分子生物学检测时 ， 仔虾或未达到 ０．５ｇ 样品可以合并样本 ， 个体稍大的虾可取个体进行检测 。 所取样品分别置于 １．５ｍＬ 无 ＲＮＡ 酶离心管中 ， 立即进行 ＲＮＡ 提取操作或加入相应体积 ＴＲＩｚｏｌ ＴＭ 总 ＲＮＡ 提取试剂 ， 暂时保存于 －２０℃ 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 犚犖犃 的提取 ８ ． １ ． １ 　 取 ３０ｍｇ ～ ５０ｍｇ 样品 ， 加入 ０．５ｍＬ ～ １ｍＬＴＲＩｚｏｌ ＴＭ 总 ＲＮＡ 提取试剂 ， 研磨 ， 室温放置 ５ｍｉｎ 。 ４℃ ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 。 取上清至新的无 ＲＮＡ 酶离心管中 。 提取过程同时设置阳性对照和阴性对照 。 ８ ． １ ． ２ 　 加入 １ ／ ５ 体积的氯仿 ， 混合至溶液乳化呈乳白色 ， 室温放置 ５ｍｉｎ 。 ８ ． １ ． ３ 　 ４℃ ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５ｍｉｎ 。 仔细吸取上