书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犆犆犛犅 ４１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０２５６ — ２０２１ 牡蛎马尔太虫病诊断规程显微镜检查组织法 犆狅犱犲狅犳犱犻犪犵狀狅狊犻狊犳狅狉犿犪狉狋犲犻犾犻狅狊犻狊狅犳狅狔狊狋犲狉狊 — 犕犻犮狉狅狊犮狅狆犻犮犿犲狋犺狅犱狊 ２０２１  ０５  ２１ 发布 ２０２１  １２  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。 本文件由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、 全国水产技术推广总站 。 本文件主要起草人 ： 白昌明 、 杨冰 、 王崇明 、 黄 絰 、 李清 、 万晓媛 、 李晨 、 辛鲁生 、 余卫忠 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０２５６ — ２０２１ 牡蛎马尔太虫病诊断规程显微镜检查组织法 １ 　 范围 本文件规定了牡蛎马尔太虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的要求 ， 针对主要病原折光马尔太虫 （ 犕犪狉狋犲犻犾犻犪狉犲犳狉犻狀犵犲狀狊 ）， 给出了组织印片检测法和组织病理检测法所需试剂或材料 、 仪器设备 、 样品 、 试验步骤和结果判定 。 本文件适用于牡蛎感染折光马尔太虫的普查和初步诊断 ， 以及牡蛎感染折光马尔太虫的流行病学调查及诊断 。 其他贝类也可参照执行 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＳＣ ／ Ｔ７２０５．１ — ２００７ 　 牡蛎包纳米虫病诊断规程 　 第 １ 部分 ： 组织印片的细胞学诊断法 ＳＣ ／ Ｔ７２０７．３ — ２００７ 　 牡蛎马尔太虫病诊断规程 　 第 ３ 部分 ： 透射电镜诊断法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＡＦＡ ： 戴维森氏乙醇  福尔马林  乙酸固定液 （ ｄａｖｉｄｓｏｎ ’ ｓａｌｃｏｈｏｌｆｏｒｍａｌｉｎａｃｅｔｉｃａｃｉｄｆｉｘａｔｉｖｅ ） ５ 　 试剂或材料 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ５ ． １ 　 苏木素 。 ５ ． ２ 　 碘酸钠 。 ５ ． ３ 　 钾明矾 。 ５ ． ４ 　 柠檬酸 。 ５ ． ５ 　 水合三氯乙醛 。 ５ ． ６ 　 伊红 Ｙ （ 水溶性 ）。 ５ ． ７ 　 焰红 Ｂ （ 水溶性 ）。 ５ ． ８ 　 石蜡 （ 熔点 ５２℃ ～ ５４℃ ）： 切片级 。 ５ ． ９ 　 中性树胶 ： 生物染色用 。 ５ ． １０ 　 甲醇 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０２５６ — ２０２１ ５ ． １１ 　 二甲苯 。 ５ ． １２ 　 无水乙醇 。 ５ ． １３ 　 ９５％ 乙醇 。 ５ ． １４ 　 甲醛 （ ３７％ ）。 ５ ． １５ 　 冰醋酸 。 ５ ． １６ 　 吉姆萨 （ Ｇｉｍｅｓａ ） 染液 。 ５ ． １７ 　 过滤海水 ： 经纱网 （ ≥ ２００ 目 ） 过滤的海水 。 ５ ． １８ 　 ＤＡＦＡ 固定液 ： 按附录 Ａ 的 Ａ．１ 配制 。 ５ ． １９ 　 迈尔  班尼特苏木精 （ ＭａｙｅｒＢｅｎｎｅｔｔＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ） 染色液 ： 按 Ａ．２ 配制 。 ５ ． ２０ 　 伊红  焰红染色液 ： 按 Ａ．３ 配制 。 ５ ． ２１ 　 ８５％ 乙醇 ： 按 Ａ．４ 配制 。 ５ ． ２２ 　 ８０％ 乙醇 ： 按 Ａ．５ 配制 。 ５ ． ２３ 　 ７５％ 乙醇 ： 按 Ａ．６ 配制 。 ５ ． ２４ 　 ７０％ 乙醇 ： 按 Ａ．７ 配制 。 ５ ． ２５ 　 ５０％ 乙醇 ： 按 Ａ．８ 配制 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 显微镜 ： 配备高倍镜 （ ４０× ） 和油镜 （ １００× ）。 ６ ． ２ 　 石蜡切片机 ： 满足 ４ μ ｍ ～ ７ μ ｍ 厚度的石蜡连续切片要求 。 ６ ． ３ 　 展片水浴锅 。 ６ ． ４ 　 烘片机 。 ６ ． ５ 　 恒温箱 。 ７ 　 样品 ７ ． １ 　 采样对象 牡蛎 、 扇贝和蛤等易感双壳贝类 。 ７ ． ２ 　 采样数量 、 方法和保存运输 采样数量 、 方法和保存运输应符合 ＳＣ ／ Ｔ７２０５．１ — ２００７ 附录 Ｂ 的要求 。 海水温度高于 １７℃ 时为采样的最佳时期 。 ７ ． ３ 　 样品的采集 稚贝 （ 附着后 ～ ２ｍｍ ） 和幼贝 （ ２ｍｍ ～ ３０ｍｍ ） 取内脏团 ； 成贝 （ ＞ ３０ｍｍ ） 取胃 、 肠道 、 消化腺和闭壳肌 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 组织印片检测法 ８ ． １ ． １ 　 印片制作 用解剖刀将样本剖开 ， 用吸水纸轻轻吸去剖面过多的黏液 ， 将剖面在载玻片上印迹 ， 制成印片 ， 自然 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０２５６ — ２０２１ 干燥后滴加甲醇覆盖印片部分 ， 固定 ５ｍｉｎ ～ ７ｍｉｎ 。 空气干燥 。 ８ ． １ ． ２ 　 染色 ８ ． １ ． ２ ． １ 　 将干燥的印片移入吉姆萨染液中染色 ， 染色时间约 ３０ｍｉｎ 。 ８ ． １ ． ２ ． ２ 　 用缓慢的自来水流或洗瓶冲洗 ， 去除多余染液 。 ８ ． １ ． ２ ． ３ 　 室温晾干 。 ８ ． １ ． ３ 　 封片 滴加 ２ 滴中性树胶 ， 封片 。 ８ ． １ ． ４ 　 观察 用显微镜低倍镜搜索适合观察的视野 ， 放大 ４００ 或 １０００ 倍观察孢子和孢囊特征 。 马尔太虫胞体细胞质为嗜碱性 ， 细胞核为嗜酸性 （ 参见附录 Ｂ ）。 ８ ． ２ 　 组织病理检测法 ８ ． ２ ． １ 　 切片制作 ８ ． ２ ． １ ． １ 　 脱水 将组织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中 ， 流程如下 ： ７５％ 乙醇 （ １ｈ４５ｍｉｎ ） → ８５％ 乙醇 （ １ｈ４５ｍｉｎ ） → ８５％ 乙醇 （ １ｈ４５ｍｉｎ ） → ９５％ 乙醇 （ ４５ｍｉｎ ） → ９５％ 乙醇 （ ４５ｍｉｎ ） → 无水乙醇 （ ４５ｍｉｎ ） → 无水乙醇 （ ４５ｍｉｎ ）。 ８ ． ２ ． １ ． ２ 　 透明 脱水后的组织块依次浸入盛有无水乙醇 ∶ 二甲苯 （ １∶１ ） 混合液和二甲苯溶液的烧杯中 ， 流程如下 ： 无水乙醇 ： 二甲苯 （ １∶１ ）（ ２５ｍｉｎ ） → 二甲苯 （ ２０ｍｉｎ ） → 二甲苯 （ ２０ｍｉｎ ）。 ８ ． ２ ． １ ． ３ 　 浸蜡 恒温箱温度调节至高于石蜡熔点 ， 流程如下 ： 透明后的组织块依次浸入两个盛有融化石蜡的烧杯中各 ８０ｍｉｎ 。 ８ ． ２ ． １ ． ４ 　 包埋 在恒温箱 （ 温度调节至高于石蜡熔点 ） 中熔蜡 ， 将熔蜡倒入包埋盒与包埋模具 （ 也可用折叠纸盒 ）， 用预温的镊子迅速夹取组织块 ， 切面朝下平放在模具底部 ； 轻轻提起模具 ， 置于冰上使其冷却凝固 。 ８ ． ２ ． １ ． ５ 　 切片 用蜡铲或刀片将包埋块四周修平 ， 使上下两面修成平行面 ， 保留组织周围附着宽 ２ｍｍ ～ ３ｍｍ 的石蜡 。 用石蜡切片机切片 ， 厚度 ５ μ ｍ 。 对每个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片 。 ８ ． ２ ． １ ． ６ 　 展片 将切片平放于展片机或水浴锅水面上 ， 待伸展平整后 ， 用载玻片捞出 ， 置于烘片机上或烘箱内 ， ４５℃ 烘片 ２ｈ 。 ８ ． ２ ． ２ 　 染色 将切片放在玻片架上 ， 依次浸入盛有不同溶液的烧杯中 ， 流程如下 ： 二甲苯 （ ５ｍｉｎ ） → 二甲苯 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０２５６ — ２０２１ （ ５ｍｉｎ ） → 无水乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → 无水乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → ９５％ 乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → ９５％ 乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → ８０％ 乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → ８０％ 乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → ５０％ 乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → 蒸馏水 （ ２ｍｉｎ ） → 蒸馏水 （ ２ｍｉｎ ） → 蒸馏水 （ ２ｍｉｎ ） → 迈尔  班尼特苏木精染色液 （ ５ｍｉｎ ） → 缓慢流动的自来水 （ ６ｍｉｎ ） → 伊红  焰红染色液 （ ２ｍｉｎ ） → ９５％ 乙醇 （ １ｍｉｎ２０ｓ ） → ９５％ 乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → 无水乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → 无水乙醇 （ ２ｍｉｎ ） → 二甲苯 （ ２ｍｉｎ３０ｓ ） → 二甲苯 （ ２ｍｉｎ３０ｓ ） → 二甲苯 （ ２ｍｉｎ３０ｓ ）。 ８ ． ２ ． ３ 　 封片 滴加 ２ 滴中性树胶 ， 封片 。 ８ ． ２ ． ４ 　 观察 用显微镜低倍镜搜索不同的视野 ， 观察组织坏死和血细胞浸润情况 ； 放大 ４００ 倍或 １０００ 倍观察孢子和孢囊特征 （ 参见附录 Ｂ ）。 ９ 　 结果判定 ９ ． １ 　 组织印片检测法 ９ ． １ ． １ 　 在折光马尔太虫病流行区域的易感宿主中 （ 参见附录 Ｃ ）， 观察到发育早期 （ 大小 ４ μ ｍ ～ ８ μ ｍ ） 和孢囊形成期