书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犆犆犛犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０２５４ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 犘犆犚 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犞犲狉狋犻犮犻犾犾犻狌犿 犖犲犲狊狌狊犻狀犵狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚 ２０２１  ０５  ２１ /G2F /G30 ２０２１  １２  ０１ /G25 /G31 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2F /G30书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中华人民共和国宁波海关 、 中国科学院微生物研究所 、 西宁市蔬菜技术服务中心 、 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国乌鲁木齐海关 。 本文件主要起草人 ： 段维军 、 蔡磊 、 张慧丽 、 赵鹏 、 张晓梅 、 郭立新 、 刘芳 、 李雪莲 、 张永江 、 张小菊 、 陈先锋 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０２５４ — ２０２１ 轮枝菌属实时荧光 犘犆犚 检疫鉴定方法 １ 　 范围 本文件描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应 （ ＰＣＲ ） 检疫鉴定方法 。 本文件适用于携带轮枝菌属病菌的土壤 、 植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文 件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于 本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ２５８９ 　 植物病原真菌检测规范 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 基本信息 中文名 ： 轮枝菌属 。 学名 ： 犞犲狉狋犻犮犻犾犾犻狌犿 Ｎｅｅｓ 。 轮枝菌属隶属于真菌界 （ Ｆｕｎｇｉ ）， 子囊菌门 （ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ ）， 盘菌亚门 （ Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ ）， 粪壳菌纲 （ Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ） 中的小不整球壳科 （ Ｐｌｅｃｔｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ ）。 传播途径 ： 轮枝菌属病菌主要由种子传播 ， 也可经病残体 、 土壤 、 风 、 灌溉水和昆虫传播 。 ５ 　 鉴定原理 根据轮枝菌属病菌的 ＤＮＡ 序列特征及实时荧光 ＰＣＲ 原理 ， 应用所设计引物或探针对轮枝菌属病 菌进行检测鉴定 。 ６ 　 仪器设备和器具 、 试剂和培养基 ６ ． １ 　 仪器设备和器具 高压灭菌锅 、 显微镜 、 解剖镜 、 天平 、 水浴锅 、 制冰机 、 纯水仪 、 涡旋振荡器 、 微量紫外分光光度计 、 高 速冷冻离心机 、 冰箱 、 超净工作台 、 生化培养箱 、 通风橱 、 实时荧光 ＰＣＲ 仪 、 微量移液器 （ ０．１ μ Ｌ ～ ２．５ μ Ｌ 、 １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ ～ ５０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）、 锥形瓶 、 培养皿 、 载玻片 、 盖玻片 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０２５４ — ２０２１ ６ ． ２ 　 试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 次氯酸钠 、 液氮 、 超纯水 、 十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ） 提取液 （ ２％ＣＴＡＢ ， １．４ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， １００ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ · ＨＣｌｐＨ８．０ ）、 Ｔｒｉｓ 饱和酚 、 三氯甲烷 、 异戊醇 、 异丙醇 、 ７０％ 乙醇 、 核糖核酸 （ ＲＮＡ ） 酶 、 ＰＣＲ 反应试剂 ： ２× 犜犪狇 ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ 。 ６ ． ３ 　 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ）： 将 ２００ｇ 马铃薯去皮 ， 切小块 ， 沸水煮 ２０ｍｉｎ 后过滤 ， 弃去滤渣 ， 在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各 ２０ｇ ， 加蒸馏水定容至 １Ｌ 。 配成溶液后 １２１℃ 下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ７ 　 检疫鉴定 ７ ． １ 　 样品的采集与处理 样品的采集 、 分离 、 纯化和培养按照 ＳＮ ／ Ｔ２５８９ 植物病原真菌检疫鉴定方法进行 。 ７ ． ２ 　 核酸的制备 采用基因组提取试剂盒制备 ＤＮＡ ， 或采用改良的 ＣＴＡＢ 提取法 ， ＣＴＡＢ 提取法应符合附录 Ａ 。 ７ ． ３ 　 犇犖犃 纯度与浓度的测定 用微量紫外分光光度计测定 ＤＮＡ 的纯度与浓度 ， 分别取得 ２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 处的吸收值 ， 计算核酸的纯度和浓度 ， 计算公式如下 ： ＤＮＡ 纯度 ＝ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ ＤＮＡ 浓度 ＝５０×ＯＤ ２６０ μ ｇ ／ ｍＬ 用于实时荧光 ＰＣＲ 检测的 ＤＮＡ 溶液的 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 比值应为 １．７ ～ １．９ 。 ７ ． ４ 　 实时荧光 犘犆犚 检测 实时荧光 ＰＣＲ 检测方法应符合附录 Ｂ 。 ８ 　 结果判定 以疑似分离物或样品的实时荧光 ＰＣＲ 检测结果作为鉴定依据 。 疑似分离物 ： 阳性对照和空白对照正常 ， 出现典型扩增曲线判定为阳性 ； 无典型扩增曲线判定为阴性 。 样品检测 ： 阳性对照和空白对照正常 ， 出现典型扩增曲线 ， 且 Ｃｔ 值 ≤ ３５ ， 判定为阳性 ； ３５ ≤ Ｃｔ 值 ≤ ４０ ， 增加 ＤＮＡ 用量 ２ 倍 ～ １０ 倍再次测试 ， 出现典型扩增曲线 ， 且 Ｃｔ 值 ≤ ３５ ， 判定为阳性 ； 其余情况判定为阴性 。 ９ 　 样品保存与复核 ９ ． １ 　 样品保存与结果记录 保存植物样品应置于 ２℃ ～ ８℃ 冰箱妥善保存 ， 对检出轮枝菌属病菌的样品应至少保存 ６ 个月 ， 以 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０２５４ — ２０２１ 备复检 、 谈判和仲裁 。 分离到的轮枝菌属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ） 中妥善保存 。 样品的来源 、 种类 、 采样时间 、 检测时间 、 地点 、 方法 、 结果等 ， 并有实验人员的签字 。 实时荧光 ＰＣＲ 要有检测阳性结果照片 。 ９ ． ２ 　 复核 由指定的单位或人员负责 ， 主要考察试验原始数据记录及实时荧光 ＰＣＲ 检测结果等资料的完整性和真实性 ， 必要时进行复核试验 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０２５４ — ２０２１ 附 　 录 　 犃 （ 规范性 ） 犇犖犃 提取方法 犃 ． １ 　 收集培养分离得到的菌丝或植物组织样品 ， 放入浸在液氮里的 １．５ｍＬ 离心管 ， 用无菌塑料杵迅速碾碎 。 犃 ． ２ 　 加入 ６００ μ Ｌ６５℃ 预热的 ＣＴＡＢ 抽提液 ， 颠倒混匀后于 ６５℃ 水浴锅 ０．５ｈ ～ １ｈ 。 犃 ． ３ 　 冷却至室温后 ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液至另一离心管中 。 犃 ． ４ 　 加入 １ ／ ２ 体积 （ ３００ μ Ｌ ） 的 Ｔｒｉｓ 饱和酚及 １ ／ ２ 体积 （ ３００ μ Ｌ ） 的三氯甲烷 ∶ 异戊醇 （ ２４∶１ ）， 颠倒混匀后静置至其开始分层 。 犃 ． ５ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液至另一离心管中 。 犃 ． ６ 　 可重复 Ａ．４ 至 Ａ．５ 步骤 ２ 次 ～ ３ 次 ， 视两相界面处杂质的多少而定 。 犃 ． ７ 　 加入等体积三氯甲烷 ∶ 异戊醇 （ ２４∶１ ）， 轻轻颠倒混匀 。 犃 ． ８ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液至另一离心管中 。 犃 ． ９ 　 向上清液中加入等体积异丙醇 ， 轻轻颠倒混合均匀后于 ４℃ 或 －２０℃ 冰箱沉淀 １ｈ 。 犃 ． １０ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃去上清液 ， 加 ５００ μ Ｌ７０％ 乙醇悬浮沉淀 。 犃 ． １１ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 弃上清液 ， 室温干燥 。 犃 ． １２ 　 加 ５０ μ Ｌ 无菌水或 ＴＥ 缓冲液 （ １０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ · ＨＣｌ ， １ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡｐＨ８．０ ） 溶解沉淀 ， －２０℃ 冰箱贮存备用 。 　　 注 ： ＤＮＡ 提取亦可采用商品化 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ４０２５４ — ２０２１ 附 　 录 　 犅 （ 规范性 ） 实时荧光 犘犆犚 方法 犅 ． １ 　 引物及探针序列 正向引物 ＶＦ ： ５′ＣＴＧＴＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＴＣＡ３′ ； 反向引物 ＶＲ ： ５′ＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＡＣＡ３′ ； 探针 ＶＰ ： ５′ＦＡＭＴＧＧＣＣＣＧＧＴＧＴＴＧＧＭＧＢ３′ ， 探针 ５′ 端含有 ＦＡＭ 报告荧光染料 ， ３′ 端含有不发荧光的淬