书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犆犆犛犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０２４９ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G27 /G29 /G2A /G2B /G2C 犘犆犚 /G2D /G2E /G2F 犆狅犱犲狅犳犱犻犪犵狀狅狊犻狊犳狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狀狑犻狋犺 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 狋狔狆犲犫犪犮狌犾狅狏犻狉狌狊 — 犘犆犚犿犲狋犺狅犱 ２０２１  ０５  ２１ /G30 /G31 ２０２１  １２  ０１ /G32 /G33 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G30 /G31书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出 。 本文件由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本文件起草单位 ： 中国水产科学研究院黄海水产研究所 、 全国水产技术推广总站 。 本文件主要起草人 ： 杨冰 、 万晓媛 、 黄 絰 、 李清 、 史成银 、 张锋 、 宋晓玲 、 余卫忠 、 张庆利 、 李晨 、 刘莉 、 许华 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０２４９ — ２０２１ 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 犘犆犚 检测法 １ 　 范围 本文件规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求 ， 针对斑节对虾杆状病毒 （ 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 ｔｙｐｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ， ＭＢＶ ）， 给出了 ＰＣＲ 检测法所需试剂或材料 、 仪器设备 、 样品 、 试验步骤和结果判定 。 本文件适用于对虾各生活期样品中 ＭＢＶ 带毒情况的定性检测 ， 以进行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ２８６３０．４ — ２０１２ 　 白斑综合征 （ ＷＳＤ ） 诊断规程 　 第 ４ 部分 ： 组织病理学诊断法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ｂｐ ： 碱基对 （ ｂａｓｅｐａｉｒ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ｄＮＴＰｓ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＢ ： 溴化乙啶 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＨＣｌ ： 盐酸 （ ｈｙｄｒｏｇｅｎｃｈｌｏｒｉｄｅ ） ＭＢＶ ： 斑节对虾杆状病毒 （ 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 ｔｙｐｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ） ＮａＯＨ ： 氢氧化钠 （ ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＤＳ ： 十二烷基硫酸 （ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） 犜犪狇 ： 水生栖热菌 （ ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ ） ＴＥ ： Ｔｒｉｓ 盐酸和 ＥＤＴＡ 缓冲液 （ ＥＤＴＡＴｒｉｓ · ＨＣｌ ） Ｔｒｉｓ ： 三羟甲基氨基甲烷 （ ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ） １ 犌犅 ／ 犜 ４０２４９ — ２０２１ ５ 　 试剂或材料 ５ ． １ 　 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ５ ． ２ 　 无水乙醇 。 ５ ． ３ 　 ＴＥ 缓冲液 ： 按附录 Ａ 中 Ａ．３ 配制 。 ５ ． ４ 　 抽提缓冲液 ： 按 Ａ．６ 配制 。 ５ ． ５ 　 蛋白酶 Ｋ ： 按 Ａ．７ 配制 。 ５ ． ６ 　 １０ｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸铵 ： 按 Ａ．８ 配制 。 ５ ． ７ 　 Ｔｉｒｓ 饱和酚 （ ｐＨ ≥ ７．８ ）。 ５ ． ８ 　 酚 ／ 氯仿 ／ 异戊醇 （ ２５∶２４∶１ ）。 ５ ． ９ 　 氯仿 ／ 异戊醇 （ ２４∶１ ）。 ５ ． １０ 　 １× 电泳缓冲液 ： 按 Ａ．１０ 配制 。 ５ ． １１ 　 ７０％ 乙醇 ： 按 Ａ．１１ 配制 。 ５ ． １２ 　 ｄＮＴＰｓ （ 各 ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 生化试剂 ， 含 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 各 ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的混合物 ， －２０℃ 保存 ， 用于 ＰＣＲ 。 ５ ． １３ 　 １０×ＰＣＲ 缓冲液 ： 生化试剂 ， 无 Ｍｇ ２＋ 离子 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １４ 　 ＭｇＣｌ ２ （ ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １５ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ ５Ｕ ／ μ Ｌ ）： 生化试剂 ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １６ 　 引物 ２６１Ｆ （ １０ｍｏｌ ／ Ｌ ）： ５′ＡＡＴＣＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡ３′ ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １７ 　 引物 ２６１Ｒ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）： ５′ＣＧＴＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＣ３′ ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １８ 　 内参引物 ＣＦ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）： ５′ＴＧＣＣＴＴＡＴＣＡＧＣＴＮＴＣＧＡＴＴＧＴＡＧ３′ ， －２０℃ 保存 。 ５ ． １９ 　 内参引物 ＣＲ （ １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）： ５′ＴＴＣＡＧＮＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＴＡＣＴＴＣＣＣ３′ ， －２０℃ 保存 。 ５ ． ２０ 　 ＰＣＲ 检测阳性对照 ： 为已知受 ＭＢＶ 感染且 ＰＣＲ 结果显示阳性的对虾组织样品 ， －８０℃ 保存 。 ５ ． ２１ 　 ＰＣＲ 检测阴性对照 ： 为已知未受 ＭＢＶ 感染且 ＰＣＲ 结果显示阴性的对虾组织样品 ， －８０℃ 保存 。 ５ ． ２２ 　 ＰＣＲ 检测空白对照 ： 灭菌双蒸水 。 ５ ． ２３ 　 琼脂糖 ： 生化试剂 。 ５ ． ２４ 　 ＤＮＡ 分子量标准 ： 生化试剂 。 ５ ． ２５ 　 ６× 载样缓冲液 ： 生化试剂 。 ５ ． ２６ 　 １０ｍｇ ／ ｍＬＥＢ 贮存液 ： 按 Ａ．１２ 配制 ， 或其他等效产品 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 ＰＣＲ 仪 。 ６ ． ２ 　 电泳仪 。 ６ ． ３ 　 水平电泳槽 。 ６ ． ４ 　 紫外观察仪或凝胶成像仪 。 ６ ． ５ 　 高速离心机 。 ６ ． ６ 　 水浴锅或金属浴 。 ６ ． ７ 　 普通冰箱 。 ６ ． ８ 　 －８０℃ 超低温冰箱 。 ６ ． ９ 　 电炉或微波炉等其他加热设备 。 ６ ． １０ 　 微量移液器 ： 量程 ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ ～ ２０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０２４９ — ２０２１ ７ 　 样品 ７ ． １ 　 采样对象 斑节对虾 （ 犘犲狀犪犲狌狊犿狅狀狅犱狅狀 ） 等易感对虾 。 参见附录 Ｂ 。 ７ ． ２ 　 采样数量 、 方法和保存运输 采样数量 、 方法和保存运输应符合 ＧＢ ／ Ｔ２８６３０．４ — ２０１２ 中附录 Ｂ 的要求 。 ７ ． ３ 　 样品的采集 ７ ． ３ ． １ 　 对虾仔虾取完整个体 ； 幼虾 、 成虾和亲虾取肝胰腺和肠道 ； 亲虾的非致死性取样可采集粪便 。 ７ ． ３ ． ２ 　 分子生物学检测时 ， 仔虾或未达到 ０．５ｇ 样品可以合并样本 ， 个体稍大的虾可取个体进行检测 。 所取样品分别置于 １．５ｍＬ 离心管中 ， 立即进行 ＤＮＡ 提取操作或暂时保存于 －２０℃ 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 犇犖犃 的提取 ８ ． １ ． １ 　 取 ３０ｍｇ ～ ５０ｍｇ 组织样品 ， 加入抽提缓冲液 ５００ μ Ｌ ， 充分研磨 ， ３７℃ 温浴 １ｈ 。 提取过程同时设置阳性对照和阴性对照 。 ８ ． １ ． ２ 　 加入 ２．５ μ Ｌ２０ｍｇ ／ ｍＬ 蛋白酶 Ｋ ， 至终浓度 １００ μ ｇ ／ ｍＬ ， 混匀后置于 ５０℃ 水浴 ３ｈ ， 不时旋动 。 ８ ． １ ． ３ 　 将溶液冷却至室温 ， 加入等体积平衡酚 ， 颠倒混合 １０ｍｉｎ ， 于 １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 分离两相 。 ８ ． １ ． ４ 　 水相移至新 １．５ｍＬ 离心管中 ， 加入等体积酚 ／ 氯仿 ／ 异戊醇 （ ２５∶２４∶１ ）， 颠倒混合 １０ｍｉｎ ， 于 １００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １ｍｉｎ 分离两相 。 ８ ． １ ． ５ 　 水相移至一新 １．５ｍＬ 离心管中