书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犆犆犛犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０１９２ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 犘犆犚 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿 犆狅狉犱犪狌狊犻狀犵狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚 ２０２１  ０５  ２１ /G2F /G30 ２０２１  １２  ０１ /G25 /G31 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2F /G30书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中华人民共和国宁波海关 、 中国科学院微生物研究所 、 中华人民共和国乌鲁木齐海关 、 中国检验检疫科学研究院 。 本文件主要起草人 ： 段维军 、 蔡磊 、 刘芳 、 李雪莲 、 王 罛 、 赵鹏 、 郭立新 、 张慧丽 、 张永江 、 陈先锋 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０１９２ — ２０２１ 刺盘孢属实时荧光 犘犆犚 检疫鉴定方法 １ 　 范围 本文件描述了植物病原真菌刺盘孢属实时荧光 ＰＣＲ 检疫鉴定方法 。 本文件适用于携带刺盘孢属病菌的植物及其产品中刺盘孢属病菌的检测筛查 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文 件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于 本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ２５８９ 　 植物病原真菌检测规范 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 刺盘孢属的分类信息 中文名 ： 刺盘孢属 。 学名 ： 犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿 Ｃｏｒｄａ 。 根据 《 ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆｔｈｅＦｕｎｇｉ 》（ 第 １０ 版 ）（ ２００８ ） 分类系统 ， 刺盘孢属隶属于真菌界 （ Ｆｕｎｇｉ ）， 子囊菌 门 （ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ ）， 粪壳菌纲 （ Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ）， 小丛壳目 （ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｌｅｓ ）， 小丛壳科 （ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｅａｅ ）。 传播途径 ： 刺盘孢属病菌主要由种子或病残体等传播 ， 也可经风 、 雨水和昆虫传播 。 ５ 　 鉴定原理 根据刺盘孢属病菌的 ＤＮＡ 序列特征 ， 采用实时荧光 ＰＣＲ 方法 ， 应用所设计引物和探针对刺盘孢 属病菌进行检测鉴定 。 ６ 　 仪器设备 、 器具 、 试剂和培养基 ６ ． １ 　 仪器设备和器具 高压灭菌锅 、 显微镜 、 解剖镜 、 天平 、 水浴锅纯水仪 、 涡旋振荡器 、 紫外分光光度计 、 高速冷冻离心机 、 冰箱 、 生化培养箱 、 实时荧光 ＰＣＲ 仪 、 微量移液器 （ ０．１ μ Ｌ ～ ２．５ μ Ｌ 、 １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ ～ ５０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ ）、 锥形瓶 、 培养皿 、 载玻片 、 盖玻片 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０１９２ — ２０２１ ６ ． ２ 　 试剂 次氯酸钠 、 液氮 、 超纯水 、 十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ） 提取液 （ ２％ＣＴＡＢ ， １．４ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， １００ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ · ＨＣｌｐＨ８．０ ）、 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓ ） 饱和酚 、 三氯甲烷 、 异戊醇 、 异丙醇 、 ７０％ 乙醇 、 核糖核酸 （ ＲＮＡ ） 酶 、 实时荧光聚合酶链式反应 （ ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ） 反应预混液 ： ２× 犜犪狇 ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ 。 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 ６ ． ３ 　 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ）： 将 ２００ｇ 马铃薯去皮 ， 切小块 ， 沸水煮 ２０ｍｉｎ 后过滤 ， 弃去滤渣 ， 在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各 ２０ｇ ， 加蒸馏水定容至 １Ｌ 。 配成溶液后 １２１℃ 下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ７ 　 检疫鉴定 ７ ． １ 　 样品的采集与处理 样品的采集 、 分离 、 纯化和培养按照 ＳＮ ／ Ｔ２５８９ 植物病原真菌检疫鉴定方法进行 。 ７ ． ２ 　 核酸的制备 采用基因组提取试剂盒制备 ＤＮＡ ， 或采用改良的十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ） 提取法 ， 十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ） 提取法按照附录 Ａ 的方法制备 。 ７ ． ３ 　 犇犖犃 纯度与浓度的测定 用紫外分光光度计测定 ＤＮＡ 的纯度与浓度 ， 分别读取 ２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 处的吸收值 ， 计为 ＯＤ ２６０ 、 ＯＤ ２８０ 。 ＤＮＡ 的纯度 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 比值应为 １．７ ～ １．９ ， ＤＮＡ 的浓度为 ５０ 倍的 ＯＤ ２６０ （ μ ｇ ／ ｍＬ ）。 ＤＮＡ 的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应 （ ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ） 检测的要求 。 ７ ． ４ 　 实时荧光 犘犆犚 检测 实时荧光 ＰＣＲ 按照附录 Ｂ 的方法检测 。 ８ 　 结果判定 以疑似分离物或样品的实时荧光 ＰＣＲ 检测结果作为鉴定依据 。 疑似分离物 ： 阳性对照和空白对照正常 ， 出现典型扩增曲线判定为阳性 ； 无典型扩增曲线判定为阴性 。 样品检测 ： 阳性对照和空白对照正常 ， 出现典型扩增曲线 ， 且 Ｃｔ 值 ≤ ３５ ， 判定为阳性 ； ３５ ≤ Ｃｔ 值 ≤ ４０ ， 增加 ＤＮＡ 用量 ２ 倍 ～ １０ 倍后再次测试 ， 出现典型扩增曲线 ， 且 Ｃｔ 值 ≤ ３５ ， 判定为阳性 ； 其余情况判定为阴性 。 ９ 　 样品保存 、 记录与复核 ９ ． １ 　 样品保存 、 记录 植物源样品应置于 ２℃ ～ ８℃ 冰箱妥善保存 ， 对检出刺盘孢属病菌的样品应至少保存 ６ 个月 ， 以备 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０１９２ — ２０２１ 复检 、 谈判和仲裁 。 分离到的刺盘孢属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ ＰＤＡ ） 中妥善保存 。 记录包括 ： 样品的来源 、 种类 、 采样时间 、 检测时间 、 地点 、 方法 、 结果等 ， 并有实验人员的签字 。 保存实时荧光 ＰＣＲ 检测阳性结果的照片 。 ９ ． ２ 　 复核 由指定的单位或人员负责 ， 主要考察试验原始数据记录及实时荧光 ＰＣＲ 检测结果等资料的完整性和真实性 ， 必要时进行复核试验 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０１９２ — ２０２１ 附 　 录 　 犃 （ 规范性 ） 十六烷基三甲基溴化铵 （ 犆犜犃犅 ） 提取 犇犖犃 方法 犃 ． １ 　 收集培养分离得到的菌丝或植物样品 ， 放入浸在液氮里的 １．５ｍＬ 离心管 ， 用无菌塑料杵迅速碾碎 。 犃 ． ２ 　 加入 ６００ μ Ｌ６５℃ 预热的十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ） 抽提液 ， 颠倒混匀后置于 ６５℃ 水浴锅中 ０．５ｈ ～ １ｈ 。 犃 ． ３ 　 冷却至室温后 ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液至另一离心管中 。 犃 ． ４ 　 加入 ６００ μ Ｌ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇混合液 （ ２４∶１ ）， 颠倒混匀后静置至其开始分层 。 犃 ． ５ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液至另一离心管中 。 犃 ． ６ 　 可重复 Ａ．４ 至 Ａ．５ 步骤 １ 次 ～ ２ 次 ， 视两相界面处杂质的多少而定 。 犃 ． ７ 　 上清液中加入等体积异丙醇 ， 轻轻颠倒混合均匀后于 ４℃ 或 －２０℃ 冰箱中沉淀 ３０ｍｉｎ 。 犃 ． ８ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清液 ， 加入 ５００ μ Ｌ７０％ 乙醇 ， 振荡洗涤 。 犃 ． ９ 　 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 弃上清液 ， 室温干燥 。 犃 ． １０ 　 加入 ５０ μ Ｌ 无菌水溶解沉淀 ， 置于 －２０℃ 冰箱中贮存备用 。 　　 注 ： ＤＮＡ 提取亦可采用商品化 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ４０１９２ — ２０２１ 附 　 录 　 犅 （ 规范性 ） 实时荧光 犘犆犚 方法 犅 ． １ 　 引物及探针序列 正向引物 ＣＬＦ ： ５′ＡＧＡＧＧＧＴＴＡＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡ３′ 。 反向引物 ＣＬＲ ： ５′ＧＡＴＴＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＡＡＧＴＣＴ３′ 。 探针 ＣＬＰ ： ５′ＦＡＭＴＧＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＣＴＴＭＧＢ３′ ， 探针 ５′ 端含有 ＦＡＭ 报告荧光染料 ， ３′ 端含有不发荧光的淬灭基团并具有 ＭＧＢ 分子 。 犅 ． ２ 　 扩增体系 ＰＣＲ 扩增反应