书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ２１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ４０１８６ — ２０２１ 微生物诱变育种致遗传物质损伤强度测定 　 犝犿狌 法 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀犲狋犻犮犿犪狋犲狉犻犪犾犱犪犿犪犵犲狊狋狉犲狀犵狋犺犳狅狉犿犻犮狉狅犫犻犪犾犿狌狋犪狋犻狅狀犫狉犲犲犱犻狀犵 — 犝犿狌犿犲狋犺狅犱 ２０２１  ０５  ２１ 发布 ２０２１  １２  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 清华大学 、 洛阳华清天木生物科技有限公司 、 华南理工大学 、 中国标准化研究院 。 本标准主要起草人 ： 张 罛 、 邢新会 、 李梅 、 剪兴金 、 王立言 、 郭肖杰 、 张乐乐 、 李爽 、 马爱进 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０１８６ — ２０２１ 微生物诱变育种致遗传物质损伤强度测定 　 犝犿狌 法 １ 　 范围 本标准规定了用生物遗传毒性 （ ｕｍｕ ） 测试方法测定微生物诱变育种致遗传物质损伤强度的方法 。 本标准适用于利用 ｕｍｕ 测试法测定诱变育种致微生物遗传物质损伤强度 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 诱变 　 犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊 通过人为的措施诱导遗传物质产生突变 。 ３ ． ２ 遗传物质损伤 　 犵犲狀犲狋犻犮犿犪狋犲狉犻犪犾犱犪犿犪犵犲 化学或物理诱变源对遗传物质分子结构的改变 。 ３ ． ３ 应急反应 　 犛犗犛狉犲狊狆狅狀狊犲 当细胞发生脱氧核糖核酸 （ ＤＮＡ ） 损伤时 ， 产生的一种应激响应机制 。 　　 注 ： 在原核生物中主要受应急反应 （ ＳＯＳｒｅｓｐｏｎｓｅ ） 系统调控 ， 调控超过 ４０ 个基因的表达来应对 ＤＮＡ 损伤 。 ３ ． ４ 遗传物质损伤强度 　 狊狋狉犲狀犵狋犺狅犳犵犲狀犲狋犻犮犿犪狋犲狉犻犪犾犱犪犿犪犵犲 化学或物理诱变源对遗传物质分子结构改变程度的大小 。 　　 注 ： 由于当细胞受到 ＤＮＡ 损伤时会发生应急修复 （ ＳＯＳ 修复 ）， 使其以突变为代价继续存活下去 ， 常用 ＳＯＳ 修复强 弱代表遗传物质损伤强度 。 ３ ． ５ 狌犿狌 测试法 　 狌犿狌狋犲狊狋 一种将编码 ＤＮＡ 聚合酶 Ｖ 中重要组分的 狌犿狌犆 基因与编码 β  半乳糖苷酶的 犾犪犮犣 基因融合 ， 导入到鼠伤寒沙门氏菌 （ 犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪狋狔狆犺犻犿狌狉犻狌犿 ） 中 ， 通过检测 β  半乳糖苷酶活性来测定 ＳＯＳ 的诱导强度的方法 。 　　 注 ： 可用于测定遗传物质损伤强度 。 １ 犌犅 ／ 犜 ４０１８６ — ２０２１ ４ 　 原理 基于 ｕｍｕ 测试方法 ， 采用荧光素 ２ β Ｄ 半乳糖苷作为 β  半乳糖苷酶的荧光底物 ， 利用碘化丙啶作为死细胞染料 ， 通过采用流式细胞荧光分选技术 （ ＦＡＣＳ ） 测定诱变后活细胞的 β  半乳糖苷酶活性 ， 从而得到活细胞的遗传物质损伤强度 。 ５ 　 试剂或材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ５ ． １ 　 １ 犿狅犾 ／ 犔 盐酸溶液 量取 ８３．３ｍＬ 的 １２ｍｏｌ ／ Ｌ 浓盐酸 ， 用水溶解定容至 １Ｌ ， 得到浓度为 １ｍｏｌ ／ Ｌ 的盐酸溶液 。 ５ ． ２ 　 １ 犿狅犾 ／ 犔 氢氧化钠溶液 称取 ４０．０ｇ 氢氧化钠 ， 用水溶解定容至 １Ｌ 。 ５ ． ３ 　 测试微生物培养基 （ 犜犌犃 ） 称取胰蛋白胨 １０．０ｇ ， 氯化钠 ５．０ｇ ， ４ 羟乙基哌嗪乙磺酸 （ ＨＥＰＥＳ ） １１．９ｇ ， 加入 ９８０ｍＬ 水溶解 ， ｐＨ 调整为 ７．０±０．２ ， 定容到 １０００ｍＬ 。 １２１℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌 。 溶解 ２．０ｇ 葡萄糖在 ２０ｍＬ 去离子水中单独灭菌 。 灭菌后按等比例混合两个溶液 ， 无菌条件下每升冷却的 ＴＧＡ 培养基中加入 ５０．００ｍｇ 氨苄青霉素 。 该溶液可以在 －２０℃ 保存 ４ 周 。 ５ ． ４ 　 荧光素  ２  β 犇 吡喃半乳糖苷 （ 犉犾狌狅狉犲狊犮犲犻狀犱犻 β 犇犵犪犾犪犮狋狅狆狔狉犪狀狅狊犻犱犲 ， 犉犇犌 ） 溶液 在 １０ｍＬ 含体积分数为 １％ 二甲基亚砜 （ ＤＭＳＯ ） 和 １％ 乙醇的水中溶解 １３．１３ｍｇＦＤＧ ， ＦＤＧ 终浓度为 ２ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， 分装后保存在 －２０℃ 冰箱中 。 使用前在 ３７℃ 预热 １５ｍｉｎ 以上 。 ５ ． ５ 　 碘化丙啶 （ 犘狉狅狆犻犱犻狌犿犻狅犱犻犱犲 ， 犘犐 ） 溶液 在 １０ｍＬＰＢＳ 溶液中溶解 ６．６８ｍｇＰＩ ， 配成浓度为 １ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＰＩ 溶液 。 用移液枪吸取 １０ μ Ｌ 浓度为 １ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＰＩ 储备液 ， 溶于 １０ｍＬＰＢＳ 溶液中 ， 配成浓度 １ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＰＩ 溶液 ， 作为 ＰＩ 工作液 。 于 ４℃ 保存 ， 使用前在冰上放置预冷 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 恒温水浴锅 ： 温度可实现 ３７℃±１℃ 。 ６ ． ２ 　 ｐＨ 计 ， 精度 ０．１ 。 ６ ． ３ 　 电子天平 ， 精度 ０．０１ｍｇ 。 ６ ． ４ 　 高速离心机 。 ６ ． ５ 　 流式细胞仪 。 ６ ． ６ 　 恒温震荡摇床 ， 温度可实现 ３７℃±１℃ ， 转速范围满足 １２５ｒ ／ ｍｉｎ ～ ２５０ｒ ／ ｍｉｎ 。 ６ ． ７ 　 紫外  可见光分光光度计 ， 可检测波长包含 ６００ｎｍ±２０ｎｍ ， 配备 １ｃｍ 比色皿 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０１８６ — ２０２１ ７ 　 样品 ７ ． １ 　 测试微生物 鼠伤寒沙门氏菌 犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪狋狔狆犺犻犿狌狉犻狌犿 ＮＭ２００９ ， 包含表达 狌犿狌犆′′犾犪犮犣 基因和氨苄青霉素抗性基因的质粒 （ 质粒序列参见附录 Ａ ）。 ７ ． ２ 　 测试微生物的保存 将 １５０ 试微测试微生物培养物置于冻存管中 ， 再加入含有 １０％ （ 体积分数 ） 二甲基亚砜或 ２０％ （ 体积分数 ） 甘油的水溶液 ３５０ μ Ｌ ， 充分混匀后 ， 保存于 －８０℃ 冰箱中 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 测试微生物过夜培养物 测试微生物过夜培养物过程如下 ： ａ ） 　 在 １００ｍＬ 三角摇瓶中装入 ２０ｍＬＴＧＡ 培养基 ， 用透气瓶塞封口 ， 灭菌储存 ； ｂ ） 　 室温融化冻存的测试微生物 ， 然后在冻存管中加入 １ｍＬＴＧＡ 培养基 ； ｃ ） 　 以 ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 转速离心冻存管中的测试微生物 １０ｍｉｎ ， 然后丢弃上清液 ， 用 １ｍＬＴＧＡ 培养基重悬测试菌 ； ｄ ） 　 用 ０．５ｍＬ 测试微生物重悬液接种到含 ＴＧＡ 培养基的三角瓶中 ， 在 ３７℃±１℃ 的恒温摇床中震荡培养过夜 （ 不超过 １２ｈ ）。 ８ ． ２ 　 准备测试微生物诱变样品和对照样品 用新鲜的 ＴＧＡ 培养基将过夜培养的测试微生物稀释 １０ 倍 ， 继续在 ３７℃±１℃ 的恒温摇床中震荡培养 ， 并设定检测波长为 ６００ｎｍ±２０ｎｍ ， 以 ＴＧＡ 培养基作为空白对照 ， 用 １ｃｍ 比色皿检测培养后测试微生物样品应处于对数生长期 。 通过物理诱变或化学诱变等方法对测试微生物样品进行诱变处理得到诱变组 ， 通过不进行诱变处理得到对照组 。 测试微生物诱变样品的量宜在 ２００ μ Ｌ 以上 ， 将诱变处理后的实验组和对照组转移到 １．５ｍＬ 离心管中 ， 在 ３７℃±１℃ 震荡培养箱中 ２００ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ２ｈ 。 ８ ． ３ 　 犉犇犌 和 犘犐 染色 取诱变组和对照组测试样品 ５０ μ Ｌ 置于 １．５ｍＬ 的离心管中 ， 在 ３７℃ 预热 ５ｍｉｎ 后 ， 加入 ３７℃ 预热的 ＦＤＧ 溶液 ５０ μ Ｌ ， 迅速温和混匀后 ， 置于 ３７℃ 水浴中 ２ｍｉｎ ， 使 ＦＤＧ 渗透进入细胞 。 再向上述 １．５ｍＬ 离心管中迅速加入 ５００ μ Ｌ 的 ＰＩ 溶液 ， 将混合液放置于冰上反应 １ｈ ， 在进行流式细胞测定前应一直将其置于冰上 。 ８ ． ４ 　 流式细胞仪测定 采用流式细胞仪对染色后样品进行流式分析 。 设定激发波长为 ４８８ｎｍ ， 对于 ＦＤＧ 水解产物荧光素的荧光强度测定接收波长为 ５２５ｎｍ （ ＦＬ１ 通道 ）， ＰＩ 染色荧光测定接收波长为 ６７０ｎｍ （ ＦＬ２ 通道 ）。 设定测定细胞总数为 ５０００ ～ １００００ 。 ８ ． ５ 　 阈值的设定 通过前向角散射光 ＦＳＣ 和侧向角散射光 ＳＳＣ 圈出目标菌体 ， 以去除多细胞粘连对结果的影响 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ４０１８６ — ２０２１ 通过单独的 ＰＩ 染色 ， 测定 ＦＬ１ 通道和 ＦＬ２ 通道的相对荧光值 ， 在 ＦＬ１ 坐标轴上圈出 ＰＩ 染色细胞 ， 圈中细胞的 ＦＬ１ 通道相对荧光值存在一个范围 ， ＦＬ１ 相对荧光值不小于这个范围的细胞为 ＰＩ 染色阴性细胞