书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆犆犛犆 ２７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ４０１７４ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A 犘狌狉犻狋狔犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳狉犲犪犵犲狀狋犲狀狕狔犿犲狊 ２０２１  ０５  ２１ /G2B /G2C ２０２１  １２  ０１ /G2D /G2E /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2B /G2C书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国工具酶标准化工作组 （ ＳＡＣ ／ ＳＷＧ１１ ） 提出并归口 。 本文件起草单位 ： 福建南生科技有限公司 、 夏禾 （ 深圳 ） 生物技术有限公司 、 苏州坤琪生物科技有限公司 、 上海鹰姿生命科技有限公司 、 雷谷 （ 厦门 ） 生物医药有限公司 、 福建华灿制药有限公司 、 厦门大学 、 安琪酵母股份有限公司 、 山东大学 、 北京化工大学 、 复旦大学 、 中国科学院微生物研究所 、 深圳华因康基因科技有限公司 。 本文件主要起草人 ： 黄发灿 、 詹学雄 、 郑登忠 、 赵晶 、 朱力 、 钟江 、 张永有 、 姚鹃 、 陈秀兰 、 陈劲春 、 刘文军 、 郭延巍 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ４０１７４ — ２０２１ 工具酶纯度的检测方法 １ 　 范围 本文件描述了工具酶纯度检测方法的术语和定义 、 原理 、 试剂或材料 、 仪器设备 、 样品制备 、 试验步骤 、 结果计算及质量控制 。 本文件适用于工具酶纯度的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＹＹ ／ Ｔ００８７ 　 电泳装置 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 工具酶纯度 　 狆狌狉犻狋狔狅犳狉犲犪犵犲狀狋犲狀狕狔犿犲狊 目标工具酶在样品总蛋白质或固含物中所占的质量百分比 。 ３ ． ２ 蛋白质含量 　 犮狅狀狋犲狀狋狅犳狆狉狅狋犲犻狀 样品经福林酚法测定出每毫克或每毫升样品中的蛋白质所占的质量 。 ３ ． ３ 固含物含量 　 犮狅狀狋犲狀狋狅犳狊狅犾犻犱 样品烘干后获得的无水固体物质在每毫克或每毫升样品中所占的质量 。 ４ 　 原理 用牛血清白蛋白标准品作对照 ， 对样品经十二烷基硫酸钠 （ ＳＤＳ ）  聚丙烯酰胺凝胶电泳后的胶带进行扫面 ， 再进行灰度值计算 ， 获得样品中目标工具酶的质量 ， 再采用福林酚法测定样品总蛋白质的质量或用炽灼残渣检查法测定样品固含物含量 ， 从而计算出工具酶纯度 。 ５ 　 试剂或材料 除非另有规定 ， 所用的试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的二级水 。 ５ ． １ 　 碱性铜溶液 称取氢氧化钠 １０ｇ ， 碳酸钠 ５０ｇ ， 加水 ４００ｍＬ 使溶解 ， 作为甲液 ； 取酒石酸钾 ０．５ｇ ， 加水 ５０ｍＬ 使 １ 犌犅 ／ 犜 ４０１７４ — ２０２１ 溶解 ， 另取硫酸铜 ０．２５ｇ ， 加水 ３０ｍＬ 使溶解 ， 将两液混合作为乙液 。 临用前 ， 甲液 、 乙液按 ５０∶１ （ 体积比 ） 混合 。 ５ ． ２ 　 福林酚溶液 称取钨酸钠 １００ｇ 、 钼酸钠 ２５ｇ ， 加水 ７００ｍＬ 、 ８５％ 磷酸 ５０ｍＬ 与盐酸 １００ｍＬ ， 置磨口圆底烧瓶中 ， 缓缓加热回流 １０ｈ ， 放冷 ， 再加硫酸锂 １５０ｇ 、 水 ５０ｍＬ 和溴数滴 ， 加热煮沸 １５ｍｉｎ ， 冷却 ， 加水稀释至 １０００ｍＬ ， 过滤 ， 滤液作为贮备液 ， 置棕色瓶中 。 临用前加一倍的水 ， 摇匀 ， 即得 。 ５ ． ３ 　 标准溶液的配制 准确称取牛血清白蛋白标准品适量 ， 用合适的溶液溶解制成 １ｍｇ ／ ｍＬ 的标准溶液 。 ５ ． ４ 　 ３０ ％ 丙烯酰胺溶液  ０ ． ８ ％ 犖 ， 犖 ′ 亚甲基双丙烯酰胺 （ 犃犮狉犅犻狊 ） 溶液 取丙烯酰胺 ３０．０ｇ ， ＡｃｒＢｉｓ０．８ｇ ， 溶于水 ， 定容到 １００ｍＬ 。 用 ０．４５ μ ｍ 微孔滤膜过滤 ， 储于棕色瓶 ， 宜 ４℃ 避光保存 。 ５ ． ５ 　 ０ ． ５ 犿狅犾 ／ 犔 三羟甲基氨基甲烷  盐酸 （ 犜狉犻狊犎犆犾 ） 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 ６．０５ｇ ， 加适量水使溶解 ， 用盐酸调 ｐＨ 值至 ６．８ ， 加水定容至 １００ｍＬ ， 宜 ４℃ 保存 。 ５ ． ６ 　 １ ． ５ 犿狅犾 ／ 犔 的 犜狉犻狊犎犆犾 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 １８．１５ｇ ， 加适量水溶解 ， 用盐酸调 ｐＨ 值至 ８．８ ， 加水定容至 １００ｍＬ ， 宜 ４℃ 保存 。 ５ ． ７ 　 １０ ％ 的 犛犇犛 溶液 称取 ２．５ｇＳＤＳ ， 加适量水溶解 ， 定容至 ２５ｍＬ ， 室温保存备用 。 ５ ． ８ 　 １０ ％ 过硫酸铵溶液 称取 １．０ｇ 过硫酸铵 ， 加适量水溶解 ， 定容至 １０ｍＬ ， 宜现配现用 。 ５ ． ９ 　 样品缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 ０．１５２ｇ 、 溴酚蓝 １ｍｇ 、 ＳＤＳ０．４ｇ ， 甘油 ２ｍＬ ， 用盐酸调 ｐＨ 值至 ６．８ ， 加水溶解并稀释至 １０ｍＬ 。 该缓冲液用于非还原型 ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 。 如用于还原型 ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ， 则再加 β  巯基乙醇 １ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 电泳缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 ３ｇ 、 甘氨酸 １４．４ｇ 、 ＳＤＳ１．０ｇ ， 加适量水溶解 ， 用盐酸调 ｐＨ 值至 ８．３ ， 加水稀释至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １１ 　 固定液 称取三氯醋酸 ５ｇ ， 加水 ２００ｍＬ 溶解后 ， 加甲醇 ２００ｍＬ ， 再加水定容至 ５００ｍＬ 。 ５ ． １２ 　 染色液 称取 １．０ｇ 考马斯亮蓝 Ｒ２５０ ， 加入甲醇 ２００ｍＬ 、 冰醋酸 ５０ｍＬ ， 加水定容至 ２５０ｍＬ ， 混匀 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ４０１７４ — ２０２１ ５ ． １３ 　 脱色液 取甲醇 ４００ｍＬ 、 冰醋酸 １００ｍＬ ， 加水定容至 １０００ｍＬ ， 混匀 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 紫外  可见分光光度计 。 ６ ． ２ 　 电泳装置 ， 应符合 ＹＹ ／ Ｔ００８７ 的要求 。 ６ ． ３ 　 凝胶薄层扫描仪 。 ６ ． ４ 　 电子分析天平 ， 分度值为 ０．０００１ｇ 。 ７ 　 样品制备 准确称取样品 犠 １ （ 若样品为液体时 ， 准确量取 ）， 用合适的溶液溶解制成 １ｍｇ ／ ｍＬ 的样品溶液 ， 按 照附录 Ａ 的方法测得样品中蛋白质含量 犆 ｙ 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 电泳 分别取样品 ８ μ Ｌ ， 标准溶液 ２ μ Ｌ 、 ４ μ Ｌ 、 ８ μ Ｌ 、 １２ μ Ｌ 、 １６ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ， 加水至 ２０ μ Ｌ ， 再加入 ２０ μ Ｌ 的 样品缓冲液 ， １００℃ 煮沸 ３ｍｉｎ ， 按照附录 Ｂ 的方法进行电泳 。 ８ ． ２ 　 扫描 取脱色好的胶片 ， 置凝胶薄层扫描仪中 ， 分别对样品和牛血清白蛋白电泳胶带进行扫描 。 ８ ． ３ 　 标准曲线的绘制 用软件计算牛血清 、 白蛋白电泳胶带灰度值 ， 以灰度值为横坐标 ， 蛋白质含量为纵坐标 ， 绘制标准曲 线 ， 见公式 （ １ ）： 犠 ＝ 犫犎 ＋ 犪 …………………………（ １ ） 　　 式中 ： 犠 ——— 蛋白质的质量 ， 单位为毫克 （ ｍｇ ）； 犎 ——— 灰度值 ； 犪 ——— 截距 ； 犫 ——— 斜率 。 ９ 　 结果计算 ９ ． １ 　 样品中目标工具酶质量的计算 用软件计算样品中目标工具酶电泳胶带的灰度值 ， 代入公式 （ １ ）， 计算出上样样品中目标工具酶的 质量 （ 犠 ２ ）。 样品中目标工具酶质量按公式 （ ２ ） 计算 ： 犠 ３ ＝ 犠 ２ × 犉 …………………………（ ２ ） ３ 犌犅 ／ 犜 ４０１７４ — ２０２１ 　　 式中 ： 犠 ３ ——— 样品中目标工具酶的质量 ， 单位为毫克 （ ｍｇ ）； 犠 ２ ——— 上样样品中目标工具酶的质量 ， 单位为毫克 （ ｍｇ ）； 犉 ——— 稀释倍数 。 ９ ． ２ 　 样品总蛋白质中工具酶纯度的计算 样品总蛋白质中工具酶纯度按公式 （ ３ ） 计算 ： 犆 ｐ ＝ 犠 ３ 犠 １ × 犆 ｙ × １００％ …………………………（ ３ ） 　　 式中 ： 犆 ｐ ——— 样品总蛋白质中工具酶纯度 ； 犠 ３ ——— 样品中目标工具酶的质量 ， 单位为毫克 （ ｍｇ ）； 犠 １ ——— 样品质量或体积 ， 单位为毫克 （ ｍｇ ） 或毫升 （ ｍＬ ）； 犆 ｙ