书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３９９２０ — ２０２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犻狀犳犲犮狋犻狅狀狑犻狋犺 犚犪狀犪狏犻狉狌狊 ２０２１  ０４  ３０ /G2C /G2D ２０２１  １１  ０１ /G2E /G2F /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2C /G2D书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 北京市水产技术推广站 、 北京海关 。 本标准主要起草人 ： 王娜 、 张 、 徐立蒲 、 景宏丽 、 张舟 、 李霆 、 张永宁 、 张利峰 、 吴绍强 、 张文 、 江育林 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３９９２０ — ２０２１ 蛙病毒感染检疫技术规范 １ 　 范围 本标准给出了两栖类动物蛙病毒感染 （ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈ 犚犪狀犪狏犻狉狌狊 ） 的临床症状 ， 规定了蛙病毒感染 的病原分离培养 、 聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测方法 。 本标准适用于蛙病毒感染的流行病学调查 、 诊断 、 检疫和疫情监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 　 出入境动物检疫采样 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ｂｐ ： 碱基对 （ ｂａｓｅｐａｉｒ ） ＣＰＥ ： 细胞病变效应 （ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ ） ＣＴＡＢ ： 十六烷基三甲基溴化铵 （ ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ｄＡＴＰ ： 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＢ ： 溴化乙锭 （ ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＥＬＩＳＡ ： 酶联免疫吸附试验 （ ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ ） ＥＰＣ ： 鲤上皮瘤细胞系 （ ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｐａｐｕｌｏｓｕｍｃｙｐｒｉｎｉｃｅｌｌｌｉｎｅ ） ＨＥＰＥＳ ： ４ 羟乙基哌嗪乙磺酸 ［ ４ （ ２Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ） １ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ ］ ＩｇＧ ： 免疫球蛋白 Ｇ （ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ ） ＭＣＰ ： 主衣壳蛋白 （ ｍａｊｏｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ ） ＯＤ ： 光密度 （ ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ ） ＰＢＳＴ ： 含有 Ｔｗｅｅｎ２０ 的磷酸盐缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅＴｗｅｅｎ２０ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） 犜犪狇 ： 水生栖热菌 （ ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ ） ＴＭＢ ： ３ ， ３′ ， ５ ， ５′ 四甲基联苯胺 （ ３ ， ３′ ， ５ ， ５′Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ） １ 犌犅 ／ 犜 ３９９２０ — ２０２１ ４ 　 试剂或材料 ４ ． １ 　 水 ： 符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 一级 。 ４ ． ２ 　 蛙病毒参考株 ： 由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供 。 ４ ． ３ 　 蛙病毒单克隆抗体 ： 由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供 。 ４ ． ４ 　 羊抗蛙病毒血清 ： 由农业农村部水生动物防疫主管部门指定机构提供 。 ４ ． ５ 　 酶标兔抗山羊 ＩｇＧ 。 ４ ． ６ 　 细胞系 ： ＥＰＣ 。 ４ ． ７ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 ： ５Ｕ ／ μ Ｌ 。 －２０℃ 保存 。 ４ ． ８ 　 ｄＮＴＰ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， －２０℃ 保存 。 ４ ． ９ 　 ＭｇＣｌ ２ ： ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， －２０℃ 保存 。 ４ ． １０ 　 引物 ： 浓度为 １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 。 ａ ） 　 正向引物 Ｆ ： ５′ＣＧＣＡＧＴＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴ３′ ； ｂ ） 反向引物 Ｒ ： ５′ＡＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣ３′ ； ｃ ） 扩增蛙病毒主衣壳蛋白 （ ＭＣＰ ） 编码基因 ， 预期长度为 ５８５ｂｐ 。 ４ ． １１ 　 无水乙醇 ： 分析纯 ， 使用前 －２０℃ 预冷 。 ４ ． １２ 　 琼脂糖 ： 电泳纯 。 ４ ． １３ 　 封闭液 ： １％ 明胶 。 ４ ． １４ 　 终止液 ： ２ｍｏｌ ／ Ｌ 的硫酸 。 ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 超净工作台 。 ５ ． ２ 　 生化培养箱 。 ５ ． ３ 　 倒置显微镜 。 ５ ． ４ 　 普通冰箱及超低温冰箱 。 ５ ． ５ 　 冷冻离心机 。 ５ ． ６ 　 高压灭菌锅 。 ５ ． ７ 　 组织研磨器 。 ５ ． ８ 　 ＰＣＲ 仪 。 ５ ． ９ 　 电泳仪 。 ５ ． １０ 　 微波炉 。 ５ ． １１ 　 凝胶成像仪 。 ５ ． １２ 　 酶标仪 。 ６ 　 临床症状 皮肤溃疡和 ／ 或远端肢体坏死 ， 参见附录 Ａ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３９９２０ — ２０２１ ７ 　 样品 按 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 的规定执行 。 采集活的两栖类动物 。 体长小于 ３ｃｍ 的 ， 切除头和尾 ， 取余下组织 ； 体长为 ３ｃｍ ～ ６ｃｍ 的 ， 取所有内脏 ； 体长大于 ６ｃｍ 的 ， 取肝 、 肾 、 脾 。 ８ 　 病毒的分离和检测 ８ ． １ 　 病毒分离培养 ８ ． １ ． １ 　 样品处理 用组织研磨器将样品匀浆成糊状 ， 按 １∶１０ 的比例将其重悬于含有 １０００ＩＵ ／ ｍＬ 青霉素和 １０００ μ ｇ ／ ｍＬ 链霉素的培养液 （ 见附录 Ｂ 中 Ｂ．１ ） 中 ， 于 １５℃ 下孵育 ２ｈ ～ ４ｈ 或 ４℃ 下孵育 ６ｈ ～ ２４ｈ 。 ７０００ｒ ／ ｍｉｎ ， ４℃ 离心 ２０ｍｉｎ ， 收集上清液 。 ８ ． １ ． ２ 　 病毒接种与观察 ８ ． １ ． ２ ． １ 　 用细胞培养液对 １∶１０ 的组织匀浆上清液再做 ２ 次 １０ 倍稀释 ， 然后将 １∶１０ 、 １∶１００ 和 １∶１０００ 三个稀释度的上清液接种到生长约 ２４ｈ 的 ＥＰＣ 单层细胞上 （ ９６ 孔板中 ）， 每个样品至少接种 ３ 孔 ， 每孔接种 １００ μ Ｌ ， 置于 ２５℃ 培养 。 试验设置 ３ 孔阳性对照 （ 接种病毒参考株 ） 和 ３ 孔空白对照 （ 未接种病毒的细胞 ）。 ８ ． １ ． ２ ． ２ 　 逐日用倒置显微镜观察细胞病变效应 （ ＣＰＥ ） 是否出现 ， 连续观察 ７ｄ 。 如果 ７ｄ 内接种组织匀浆上清液的细胞培养物未出现 ＣＰＥ ， 需盲传一次 。 盲传时 ， 将接种组织匀浆上清液的细胞培养物冻融一次后收集 ， ７０００ｒ ／ ｍｉｎ ， ４℃ 离心 ２０ｍｉｎ ， 收集上清液 。 将上清液 １００ μ Ｌ 接种到同种长满单层新鲜细胞的 ９６ 孔板中 ， 置于 ２５℃ 培养 ， 再观察 ７ｄ 。 ８ ． １ ． ２ ． ３ 　 如果空白对照细胞形态正常 ， 阳性对照孔细胞出现 ＣＰＥ ， 当接种被检匀浆上清稀释液的细胞或盲传后的细胞出现 ＣＰＥ 时 ， 应立即取病毒悬液用 ＰＣＲ 或 ＥＬＩＳＡ 方法进行病毒的检测 。 如果仅有阳性对照出现 ＣＰＥ ， 样品经过接种细胞和盲传后均没有 ＣＰＥ 出现 ， 则结果判为阴性 。 如果阳性对照未出现 ＣＰＥ ， 则试验无效 ， 应重新进行试验 。 ８ ． ２ 　 犘犆犚 检测 ８ ． ２ ． １ 　 样品处理 如果是组织样品 ， 取 ５０ｍｇ ～ １００ｍｇ 组织 。 先加入 １５０ μ ＬＣＴＡＢ 溶液 （ 见 Ｂ．３ ）， 用组织研磨器将 样品匀浆成糊状 ， 放入 １．５ｍＬ 的离心管中 ，