书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆犆犛犆 ２７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３９７２９ — ２０２０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G21 /G22 /G25 /G26 /G2D 犌犲狀犲狉犪犾狉犲狇狌犻狉犲犿犲狀狋狊犳狅狉犿犲犪狊狌狉犲犿犲狀狋狅犳犮犲犾犾狆狌狉犻狋狔 — 犉犾狅狑犮狔狋狅犿犲狋狉狔 ２０２０  １２  １４ /G2E /G2F ２０２１  ０７  ０１ /G30 /G31 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2E /G2F目 　　 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅱ ………………………………………………………………………………………………………… １ 　 范围 １ ……………………………………………………………………………………………………… ２ 　 规范性引用文件 １ ………………………………………………………………………………………… ３ 　 术语 、 定义和缩略语 １ ……………………………………………………………………………………… ４ 　 方法原理 １ ………………………………………………………………………………………………… ５ 　 通用要求 ２ ………………………………………………………………………………………………… 　 ５．１ 　 试剂或材料 ２ ………………………………………………………………………………………… 　 ５．２ 　 仪器设备 ２ …………………………………………………………………………………………… 　 ５．３ 　 样本制备 ３ …………………………………………………………………………………………… 　 ５．４ 　 试验步骤 ３ …………………………………………………………………………………………… 　 ５．５ 　 数据分析 ５ …………………………………………………………………………………………… 　 ５．６ 　 方法确认 ５ …………………………………………………………………………………………… 　 ５．７ 　 报告 ５ ………………………………………………………………………………………………… 参考文献 ６ ……………………………………………………………………………………………………… 犌犅 ／ 犜 ３９７２９ — ２０２０ 前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由国家标准物质研究中心提出并归口 。 本文件起草单位 ： 中国计量科学研究院 。 本文件主要起草人 ： 刘瑛颖 、 王晶 、 陈川 、 傅博强 、 袁宝珠 、 牛春艳 、 隋志伟 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３９７２９ — ２０２０ 引 　　 言 　　 细胞纯度是评价和分析细胞样本特性与细胞产品质量的基本参数 ， 因此医学检验 、 生物医药研发 、 生产和质量检验等领域需要广泛开展细胞纯度的测量 。 流式细胞术可对液体中悬浮单颗粒或细胞进行高速 、 多参数分析 ， 是一种常用的细胞纯度测量方法 。 为了实现不同实验室 、 平台 、 操作人员等测量系统条件之间的数据一致性 ， 需要对通过流式细胞术进行细胞纯度试验的技术环节标准化 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３９７２９ — ２０２０ 细胞纯度测定通用要求流式细胞测定法 １ 　 范围 本文件描述了流式细胞仪测定细胞纯度的术语 、 定义和缩略语 、 方法原理 ， 以及包括试剂或材料 、 仪 器设备 、 样本制备 、 试验步骤 、 数据分析 、 方法确认和报告的通用要求 。 本文件适用于研究 、 生产与检验中通过流式细胞仪进行的细胞纯度的测定 。 ２ 　 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 。 ３ 　 术语 、 定义和缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 目标细胞 　 犮犲犾犾狅犳狋犲狊狋犻狀犵狋犪狉犵犲狋 与检测目标相一致 ， 具有流式细胞仪可检测特征 （ 如大小 、 数量 、 特定标志物 ） 的细胞 。 ３ ． １ ． ２ 细胞纯度 　 犮犲犾犾狆狌狉犻狋狔 目标细胞占样本总细胞数量的百分率 。 ３ ． １ ． ３ 细胞染色 　 犮犲犾犾狊狋犪犻狀犻狀犵 细胞特定成分与荧光染料或标记了荧光染料的特异性抗体结合后进行检测的一种技术 。 　　 注 ： 特定成分为蛋白质 、 ＤＮＡ 、 ＲＮＡ 等 。 ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＦＳＣ ： 前向角散射光 （ ＦｏｒｗａｒｄＳｃａｔｔｅｒ ） ＳＳＣ ： 侧向角散射光 （ ＳｉｄｅＳｃａｔｔｅｒ ） ４ 　 方法原理 使用流式细胞仪 ， 通过总细胞和目标细胞不同的光学 （ 散射光和荧光 ） 特性 ， 对待测样本中的总细胞 和目标细胞进行区分和计数 。 根据总细胞和目标细胞的测量数量 ， 计算得到目标细胞纯度 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３９７２９ — ２０２０ ５ 　 通用要求 ５ ． １ 　 试剂或材料 ５ ． １ ． １ 　 荧光染料 选择的荧光染料应能被试验所用流式细胞仪的激光器激发 ， 其激发光信号能被流式细胞仪的检测器接收 。 ５ ． １ ． ２ 　 荧光染料标记的抗体 确保选择的荧光染料标记的抗体对目标细胞具有特异性 。 ５ ． １ ． ３ 　 鞘液 鞘液应为无荧光本底的平衡电解质溶液 ， 其洁净度 、 吸光度 、 ｐＨ 值 、 渗透压应满足流式细胞仪的要求 。 ５ ． １ ． ４ 　 缓冲溶液 缓冲溶液不应造成待测细胞的破裂 、 形态严重改变或者聚团 ， 不应对待测细胞的光学特性产生显著影响 ， 一般为不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液 ， 配制要求和方法应根据具体细胞类型确定 。 ５ ． １ ． ５ 　 固定剂 固定剂不应造成待测细胞染色后的光学特性和形态严重改变 。 ５ ． １ ． ６ 　 荧光补偿样品 荧光补偿样品为单荧光染色细胞或者荧光补偿微球 。 荧光补偿样品的荧光染料应与待测细胞所用的荧光染料一致 。 荧光补偿样品的荧光强度至少要与待测细胞一致 ， 或者超过待测细胞的荧光强度 。 ５ ． ２ 　 仪器设备 ５ ． ２ ． １ 　 流式细胞仪 具有荧光检测通道和散射光检测通道 ， 荧光通道能够检测选择的荧光染料 ， 散射光检测通道包括 ＦＳＣ 和 ＳＳＣ 。 流式细胞仪应经过校准 ， 并定期核查准确性和精密度 。 ５ ． ２ ． ２ 　 微量移液器 微量移液器量程为 １０ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 微量移液器应经过检定或校准 ， 并定期核查其移取量的准确度和精密度 。 ５ ． ２ ． ３ 　 涡旋振荡器 涡旋振荡器使用的涡旋转速不应大于 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 使用者应监测并记录涡旋振荡器的使用转速 、 时长等条件 。 ５ ． ２ ． ４ 　 温度控制装置 用于细胞染色的孵育温度控制或试剂 、 样本的保存 ， 例如冰箱 。 使用者应监测并记录温度控制装置 ２ 犌犅 ／ 犜 ３９７２９ — ２０２０ 的温度准确性和稳定性 。 ５ ． ３ 　 样本制备 ５ ． ３ ． １ 　 细胞制备 根据原始样本的类型选择合适的待测样本制备方式 。 待测样本应是单分散细胞悬液 ， 即待测样本 中的细胞以单个细胞存在 ， 没有细胞团或细胞碎片 。 ５ ． ３ ． ２ 　 样本运送 运送条件不应影响待测细胞的生物特性和检测结果 。 ５ ． ３ ． ３ 　 标识 待测样本应具有标签 ， 标签上注明样本类型 、 样本采集和制备的时间和地点 。 ５ ． ３ ． ４ 　 细胞染色 细胞染色前 ， 应根据流式细胞仪的性能参数 、 待测细胞的黏附 、 自然沉降等特性来调整样本中的细 胞浓度 。 如果细胞浓度过高 ， 可用缓冲溶液对待测样本进行稀释 ， 并记录稀释倍数 。 根据荧光染料或特异性的荧光染料标记抗体质量参数确定样本量及染料 、 抗体浓度 、 孵育条件 。 保证待测样本和荧光染料或特异性的荧光染料标记抗体充分混合 ， 应选择合适的涡旋转速和时长 ， 转速过高或时间过长会造成细胞破损 。 待测样本完成细胞染色后 ， 应尽快进行上机检测 。 如果无法尽快上机检测 ， 应通过固定剂进行固定并适当条件保存 ， 宜 ４℃ ～ ８℃ 避光保存 。 ５ ． ４ 　 试验步骤 ５ ． ４ ． １ 　 工作条件 应根据流式细胞仪的仪器说明书设置仪器的工作条件 ， 包括环境温度 、 湿度 、 电源电压 、 大气压力 、 环境光照等 。 ５ ． ４ ． ２ 　 开机校验 每次开机后 ， 对流式细胞仪的光路系统进行校验 ， 可参考流式细胞仪的校验参数检测 ＦＳＣ 、 ＳＳＣ 和 各荧光通道的平均荧光强度 、 变异系数和荧光分辨率 。 ５ ． ４ ． ３ 　 细胞纯度的测量 ５ ． ４ ． ３ ． １ 　 设置对照 应设置阴性对照 、 阳性对照 、 同型对照 、 荧光扣除对照 ， 用于识别目标细胞并确认目标细胞的染色方 案是否正确 。 使用不含任何荧光染料的待测细胞样