书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ４０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３９５１２ — ２０２０ 磷酸化标记核酸检测通则 犘狉犻狀犮犻狆犾犲犳狅狉狆犺狅狊狆犺狅狉狔犾犪狋犻狅狀犾犪犫犲犾犲犱狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱狋犲狊狋犻狀犵 ２０２０  １１  １９ 发布 ２０２１  ０６  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国测试技术研究院生物研究所 、 通用生物系统 （ 安徽 ） 有限公司 、 四川省亚中基因科技有限责任公司 、 深圳市计量质量检测研究院 、 中国测试技术研究院 、 成都先导药业开发股份有限公司 、 苏州金唯智生物科技有限公司 、 四川大学华西医院 、 四川农业大学 、 河北医科大学 。 本标准主要起草人 ： 周李华 、 雍金贵 、 韩国全 、 刘宗文 、 杨杰斌 、 潘红 、 李怀平 、 张懿 、 马丽侠 、 杨国武 、 刘倩 、 蒋子敬 、 杨丽 、 郝军政 、 郑燕燕 、 吕品 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３９５１２ — ２０２０ 磷酸化标记核酸检测通则 １ 　 范围 本标准规定了磷酸化标记核酸检测的术语和定义 、 缩略语 、 一般要求 、 测定方法 、 样品保存和报告 。 本标准适用于 ＤＮＡ 编码化合物文库构建用的磷酸化标记核酸的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ３０９８８ 　 多酚类植物基因组 ＤＮＡ 提取纯化及测试方法 ＧＢ ／ Ｔ３０９８９ 　 高通量基因测序技术规程 ＧＢ ／ Ｔ３４７９７ 　 核酸引物探针质量技术要求 ３ 　 术语和定义 ＧＢ ／ Ｔ３４７９７ 界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 磷酸化标记核酸 　 狆犺狅狊狆犺狅狉狔犾犪狋犻狅狀犾犪犫犲犾犲犱狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱 ５′ 端标记一个磷酸基团 ， 长度范围在 ９ｎｔ ～ １７ｎｔ 的单链 ＤＮＡ 。 ３ ． ２ 犇犖犃 编码化合物 　 犇犖犃犲狀犮狅犱犲犱犮狅犿狆狅狌狀犱 具有 ５′ 端标记磷酸基团 ， ３′ 端带有 ２ ～ ６ 个碱基黏末端 ， ９ｎｔ ～ １７ｎｔ 的两条单链 ＤＮＡ 退火形成的 双链 。 ３ ． ３ 退火 　 犪狀狀犲犪犾犻狀犵 两条单链 ＤＮＡ 通过加热变性 、 降温复性的方式 ， 依据碱基互补配对原则结合在一起 。 ３ ． ４ 互补链 　 犮狅犿狆犾犲犿犲狀狋犪狉狔狊狋狉犪狀犱 通过碱基互补配对形成的双链核苷酸链中的两条单链 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＩＥＡ ： 犖 ， 犖  二异丙基乙胺 （ Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ ） １ 犌犅 ／ 犜 ３９５１２ — ２０２０ ＨＦＩＰＡ ： 六氟异丙醇 （ Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ） ＨＰＬＣ ： 高效液相色谱 （ ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ） ＬＣＭＳ ： 液相色谱  质谱联用仪 （ ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ） ＯＤ ： 光密度 （ ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ ） ＴＥＡＡ ： 三乙基铵醋酸盐 （ ＴｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＡｃｅｔａｔｅ ） ５ 　 磷酸化标记核酸检测一般要求 ５ ． １ 　 样品要求 检测样品应为无色或浅黄色澄清液体 ， 无悬浮物 ， 无机械杂质 。 样品管保存完好 ， 无破损 、 无漏液 。 ５ ． ２ 　 人员要求 进行磷酸化标记核酸检测的人员应具有生物 、 化学专业知识的教育背景 。 ５ ． ３ 　 试剂要求 除非另有说明 ， 在检测中使用的试剂均为分析纯试剂 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ５ ． ４ 　 检测项目 磷酸化标记核酸的检测项目参见表 １ ， 指标参数的参考结果参见附录 Ａ 。 表 １ 　 磷酸化标记核酸检测指标及测定仪器 样品 指标项目 测定方法 仪器设备 磷酸化标记核酸总量 ６．１ 紫外分光光度计 相对分子质量 ６．２ ＬＣＭＳ 碱基准确度 ６．３．２ ＬＣＭＳ ６．３．３ 测序仪 纯度紫外吸收强度 ６．４．１ 紫外分光光度计 ＨＰＬＣ 纯度 ６．４．２ ＨＰＬＣ 仪 质谱纯度 ６．４．３ ＬＣＭＳ 碱基缺失率完全匹配度 ６．５．２ 测序仪 碱基缺失率 ６．５．１ ＬＣＭＳ 互补链浓度差紫外吸收强度 ６．６．１ 紫外分光光度计 质谱峰强度比 ６．６．２ ＬＣＭＳ 化合物间浓度差 ６．６．３ 紫外分光光度计 脱磷酸化产物 脱磷酸产物占比 ６．７ ＬＣＭＳ 连接效率原料胶图转化率 ／ 相对分子质量 ６．８ 凝胶电泳仪 ／ ＬＣＭＳ ２ 犌犅 ／ 犜 ３９５１２ — ２０２０ ６ 　 测定方法 ６ ． １ 　 总量检测 按照 ＧＢ ／ Ｔ３４７９７ 执行 。 ６ ． ２ 　 相对分子质量检测 ６ ． ２ ． １ 　 直接计算 相对分子质量可依据定制序列 ， 按照式 （ １ ） 直接计算 ： ＭＷ ＝ （ 犃 × ３１３ ． ２１ ） ＋ （ 犆 × ２８９ ． １８ ） ＋ （ 犌 × ３２９ ． ２１ ） ＋ （ 犜 × ３０４ ． ２ ） ＋ ７９ ． ９８ － ６１ ． ９４ …………（ １ ） 　　 式中 ： ＭＷ 　　 ——— 相对分子质量 ； 犃 ， 犆 ， 犌 ， 犜 ——— 各碱基相对应的碱基数 ； ７９．９８ ——— ５′ 磷酸基团相对分子质量 ； ６１．９４ ——— 磷酸二酯键残基相对分子质量 。 ６ ． ２ ． ２ 　 质谱检测 采用 ＬＣＭＳ 对磷酸化标记核酸的相对分子质量 （ ＭＷ ） 进行检测 ， ＬＣＭＳ 通过电喷雾电离源将样品转化为运动的带电气态离子碎片 ， 然后按质荷比 （ 犿 ／ 狕 ） 大小分离并记录 ， 通过质谱分析软件换算出目标化合物的相对分子质量 。 仪器运行前检查确认仪器的离子源 、 检测器 、 数据系统等状态正常 ， ＬＣＭＳ 的设备参数及流动相参数参考附录 Ｂ 中的 Ｂ．１ 。 ６ ． ２ ． ３ 　 测定结果 采用 ６．２．２ 方法测得的相对分子质量 （ ＭＷ ） 与 ６．２．１ 中计算的相对分子质量 （ ＭＷ ） 进行比较得出相对误差 。 ６ ． ３ 　 碱基准确度检测 ６ ． ３ ． １ 　 总则 磷酸化标记核酸序列和定制序列的匹配程度 ， 由合成仪自动生成的序列信息与质谱检测 、 测序检测的结果进行比对验证 。 ６ ． ３ ． ２ 　 液相色谱  质谱法 采用 ６．２．２ 方法测定 ， 将测得的相对分子质量与 ６．２．１ 中定制序列的理论相对分子质量 （ ＭＷ ） 进行比对验证 。 ６ ． ３ ． ３ 　 基因测序法 按照 ＧＢ ／ Ｔ３０９８９ 执行 ， 对磷酸化标记核酸进行序列测定 。 ６ ． ４ 　 纯度检测 ６ ． ４ ． １ 　 紫外分光光度法 按照 ＧＢ ／ Ｔ３０９８８ 执行 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３９５１２ — ２０２０ ６ ． ４ ． ２ 　 高效液相色谱法 采用 ＨＰＬＣ 仪对磷酸化标记核酸的纯度进行测定 ， 设备运行参数参考 Ｂ．２ 。 确保仪器状态正常后 ， 取 １０ μ Ｌ５０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸化标记核酸溶液和 ２０ μ Ｌ 超纯水置于进样瓶中混匀 ， 点击仪器运行按钮 ， 仪器自动进样检测 。 根据检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值 ， 得出磷酸化标记核酸的纯度 。 ６ ． ４ ． ３ 　 液相色谱  质谱法 采用 ６．２．２ 方法测定 ， 计算目标峰质谱信号的强度占所有峰质谱信号强度的比值 ， 得出磷酸化标记核酸的质谱纯度 。 ６ ． ５ 　 碱基缺失率检测 ６ ． ５ ． １ 　 液相色谱  质谱法 采用 ６．２．２ 方法测定 ， 计算缺碱基峰的质谱信号强度占所有峰质谱信号强度的比值 ， 得出碱基缺失率 。 ６ ． ５ ． ２ 　 基因测序法 采用 ６．３．３ 方法测定 ， 计算碱基缺失信号比例 。 ６ ． ６ 　 互补链浓度差检测 ６ ． ６ ． １ 　 紫外吸收强度检测 ６ ． ６ ． １ ． １ 　 单链浓度检测 采用紫外分光光度法对磷酸化标记核酸进行紫外吸收强度检测 ， 测得核酸在 ２６０ｎｍ 处的吸收强度即 ＯＤ ２６０ 数值 ， 测得的 ＯＤ ２６０ 数值乘以稀释倍数作为最终定量的 ＯＤ ２６０ 数值 ， 用 ＯＤ ２６０ 数值除以消光系数转换为样品浓度 。 ６ ． ６ ． １ ． ２ 　 互补链浓度差 根据单链定量结果 ， 计算两条互补链间的浓度差 。 　　 注 ： 检测前离心并混匀样本 ， 样本量大时 ， 可采用摇床 ６００ｒ ／ ｍｉｎ ， ２５℃ ， １０ｍｉｎ 混匀 。 ６ ． ６ ． ２ 　 质谱峰强度比检测 采用 ６．２．２ 方法测定 ， 计算双链中含量较低的单链质谱信号强度占双链总质谱信号强度的比值 。 ６ ． ６ ． ３ 　 化合