书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３８７４０ — ２０２０ 实验动物 　 猴马尔堡病毒检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊犻犿犻犪狀犕犪狉犫狌狉犵狏犻狉狌狊 （ 犕犃犚犞 ） ２０２０  ０４  ２８ 发布 ２０２０  ０８  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国实验动物标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２８１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、 中华人民共和国福州海关 、 中华人民共和国成都海关 、 中华人民共和国海口海关 、 中华人民共和国济南海关 、 北京脑科学与类脑研究中心 、 中华人民共和国海口海关 、 中华人民共和国昆明海关 。 本标准主要起草人 ： 李丹丹 、 张体银 、 安微 、 王绥家 、 凌宗帅 、 李文龙 、 陈平亚 、 艾军 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８７４０ — ２０２０ 实验动物 　 猴马尔堡病毒检测方法 １ 　 范围 本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的操作方法 。 本标准适用于猴马尔堡病毒的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 　 出入境动物检疫采样 ＧＢ１９４８９ 　 实验室 　 生物安全通用要求 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 马尔堡病毒 　 犕犪狉犫狌狉犵狏犻狉狌狊 一种高致病性病毒 ， 属丝状病毒科 （ Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ ）， 单股负链 ＲＮＡ 病毒 ， 基因组约 １９．１ｋｂ ， 为已知的最大的负链 ＲＮＡ 病毒 。 ３ ． ２ 逆转录实时荧光聚合酶链式反应 　 狉犲犪犾狋犻犿犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ； 狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚 将 ｍＲＮＡ 逆转录为 ｃＤＮＡ 后再作为模板进行实时荧光 ＰＣＲ 扩增 。 ＰＣＲ 反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针 ， 该探针为一寡核苷酸片段 ， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 。 探针完整时 ， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ； ＰＣＲ 特异性扩增时 ， 犜犪狇 酶的 ５′３′ 外切酶活性将探针酶切降解 ， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 ， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号 ， 实现了荧光信号的累积与 ＰＣＲ 产物形成完全同步 。 ３ ． ３ 噪音 　 狀狅犻狊犲 荧光 ＰＣＲ 仪在仅仅使用 ＰＣＲ 管和水的状态下的本底荧光强度 。 ３ ． ４ 犆狋 值 　 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱狏犪犾狌犲 从基线到指数增长的拐点所对应的 ＰＣＲ 反应循环次数 。 ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３８７４０ — ２０２０ ＤＥＰＣ ： 焦碳酸二乙酯 （ ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＦＡＭ ： ６ 羧基荧光素 （ ６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ） ＭＡＲＶ ： 马尔堡病毒 （ Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＲＴＰＣＲ ： 逆转录聚合酶链式反应 （ ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＤＳ ： 十二烷基硫酸钠 （ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） ＴＡＭＲＡ ： ６ 羧基四甲基若丹明 （ ６ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ） 犜犪狇 酶 ： 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ 犜犪狇 ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） Ｔｒｉｓ ： 三 （ 羟甲基 ） 氨基甲烷 ［ ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ］ ５ 　 试剂或材料 本标准所用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水的规格要求 。 ５ ． １ 　 裂解液 ： Ｔｒｉｚｏｌ 或其他等效裂解液 。 ５ ． ２ 　 三氯甲烷 ∶ 异戊醇 ： 体积比 ２４∶１ 。 ５ ． ３ 　 异丙醇 ： －２０℃ 预冷 。 ５ ． ４ 　 磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳ ）： 见附录 Ａ 中的 Ａ．１ 。 ５ ． ５ 　 无 ＲＮａｓｅ 水 ： 见 Ａ．２ 。 ５ ． ６ 　 ７５％ 乙醇 ： 见 Ａ．３ 。 ５ ． ７ 　 逆转录酶 ： －２０℃ 保存 ， 避免温度剧烈变化 。 ５ ． ８ 　 １０×ＲＴＰＣＲ 缓冲液 。 ５ ． ９ 　 ｄＮＴＰｓ ： 含 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 ２．５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 ５ ． １０ 　 ＭｇＣｌ ２ ： ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 ５ ． １１ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融或温度剧烈变化 。 ５ ． １２ 　 ＲＮＡ 酶抑制剂 。 ５ ． １３ 　 阳性对照 ： 体外转录的 、 非感染性的 、 猴马尔堡病毒阳性 ＲＮＡ 片段 ， ＤＮＡ 序列参见附录 Ｂ 。 ５ ． １４ 　 阴性组织对照 ： 猴马尔堡病毒阴性组织样品 。 ５ ． １５ 　 引物和探针 ， 浓度为 １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ， 序列如下 ： 上游引物 ＭＡＲＶＦ ： ５′ＴＴＧＧＴＧＣＧＧＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＴ３′ ； 下游引物 ＭＡＲＶＲ ： ５′ＧＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡ３′ ； 探针 ： ５′ＦＡＭＡＧＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＡＧＣＣＣＧＡＢＨＱ１３′ 。 ６ 　 仪器设备 ６ ． １ 　 荧光定量 ＰＣＲ 核酸扩增仪 。 ６ ． ２ 　 生物安全柜 。 ６ ． ３ 　 电子天平 。 ６ ． ４ 　 高速冷冻离心机 ， 台式离心机 。 ６ ． ５ 　 冷藏冷冻冰箱 。 ６ ． ６ 　 组织匀浆器 。 ６ ． ７ 　 旋涡振荡器 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８７４０ — ２０２０ ６ ． ８ 　 微量可调移液器 ： ２ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ 。 ６ ． ９ 　 低温冰箱 ， 温度 ≤ －７０℃ 。 ７ 　 样品采集 ７ ． １ 　 生物安全要求 样品的采集 、 保存及运输过程中应做好相关人员生物安全保护 ， 并符合 ＧＢ ／ Ｔ１８０８８ 的相关要求 。 样品的处理应在具有生物安全 ３ 级条件的实验室中进行 ， 实验室条件符合 ＧＢ１９４８９ 要求 。 ７ ． ２ 　 取样工具 棉拭子 、 剪刀 、 镊子 、 离心管 、 一次性无菌注射器 ， 上述取样工具应无菌 。 ７ ． ３ 　 血液样品 用无菌注射器直接吸取血液至 １．５ｍＬ 无菌抗凝离心管中 ， 编号备用 。 ７ ． ４ 　 肛拭子或者粪便 将灭菌的棉拭子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动 ， 然后将拭子放入装有 １．５ｍＬＰＢＳ 的离心管内 ， 加盖 、 编号 。 棉拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约 ５ｓ 后 ， 于离心机中瞬时离心 ， 立即使用或 －２０℃ 备用 。 ７ ． ５ 　 内脏样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检动物的肝脏 、 肾脏 、 心脏或者脾脏约 ２．０ｇ 于组织匀浆器中 ， 加入 １０ｍＬＰＢＳ 匀浆 ， 然后将组织悬液转入无菌 １．５ｍＬ 离心管中 ３０００ 犵 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液转入另一无菌 １．５ｍＬ 离心管中 ， 编号备用 。 ７ ． ６ 　 存放和运送 采集或处理的样本在 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存应不超过 ２４ｈ ； 若长期保存 ， 应放置 －７０℃ 冰箱 ， 避免反复冻融 （ 最多冻融 ３ 次 ）。 采集的样品密封后 ， 采用保温壶或保温桶加冰密封 ， 尽快运送到实验室 。 ８ 　 试验步骤 ８ ． １ 　 实验室生物安全要求 病原样本的检测应在生物安全 ３ 级条件的实验室中进行 ， 实验室条件符合 ＧＢ１９４８９ 要求 。 ８ ． ２ 　 样本核酸提取 ８ ． ２ ． １ 　 在样本处理区进行 。 为防止 ＲＮＡ 降解 ， 所用试验用具及溶液应无 ＲＮＡ 酶 ， 操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套 。 ８ ． ２ ． ２ 　 取 ２００ μ Ｌ 病毒液或已处理好的样品加入到无 ＲＮＡ 酶的 １．５ｍＬ 离心管中 ， 加入 ６００ μ ＬＴｒｉｚｏｌ 试剂 ， 用旋涡振荡器剧烈振荡 １５ｓ 后 ， 室温放置 ５ｍｉｎ 。 ８ ． ２ ． ３ 　 加入 ２００ μ Ｌ 三氯甲烷 ， 用旋涡振荡器剧烈振荡 １５ｓ 后室温放置 ３ｍｉｎ ， ４℃ ， １２０００ 犵 离心 １５ｍｉｎ 。 ８ ． ２ ． ４ 　 吸取上清液转移至一个新的无 ＲＮＡ 酶的 １．５ｍＬ 离心管中 ， 加入 ５００ μ Ｌ 异丙醇 ， 上下颠倒混 ３ 犌犅 ／ 犜 ３８７４０ — ２０２０ 匀 ，