书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ４０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３８５０５ — ２０２０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 犌犲狀犲狉犪犾犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊狅犳犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱狆狉狅犱狌犮狋狊 ２０２０  ０３  ０６ /G2C /G2D ２０２０  ０３  ０６ /G2E /G2F /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2C /G2D书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 、 辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、 甘肃中商食品质量检验检测有限公司 、 广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、 吉林省农业科学院 、 上海市计量测试技术研究院 、 甘肃省商业科技研究所有限公司 。 本标准主要起草人 ： 付伟 、 王晨光 、 朱鹏宇 、 杜智欣 、 魏霜 、 朱海 、 洪霞 、 郑秋月 、 付辉 、 何海宁 、 李飞武 、 金虹 、 安小苹 、 朱水芳 、 马涛 、 刘刚 、 杨光瑞 、 曹际娟 、 袁顺捷 、 黄文胜 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８５０５ — ２０２０ 转基因产品通用检测方法 １ 　 范围 本标准规定了转基因产品的定性检测方法 。 本标准适用于水稻 、 玉米 、 大豆 、 油菜 、 马铃薯 、 甜菜 、 苜蓿等及其加工产品中转基因成分的实时荧光 ＰＣＲ 通用检测 。 本标准方法的最低检出限为 ０．１％ （ 质量分数 ）。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．１ 　 转基因产品检测 　 通用要求和定义 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．３ 　 转基因产品检测 　 核酸提取纯化方法 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．７ 　 转基因产品检测 　 抽样和制样方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 　 １８ 犛狉犚犖犃 基因 　 １８ 犛狉犚犖犃犵犲狀犲 转录自 １８ＳｒＤＮＡ ， 细胞核糖体的组分之一 ， 作为植物内源基因 。 ３ ． ２ 　 犆犪犕犞 ３５ 犛 启动子 　 ３５ 犛狆狉狅犿狅狋犲狉犳狉狅犿 犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 来自花椰菜花叶病毒 （ 犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 ， ＣａＭＶ ） 的 ３５Ｓ 启动子 。 ３ ． ３ 　 犆犪犕犞 ３５ 犛 终止子 　 ３５ 犛狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉犳狉狅犿 犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 来自花椰菜花叶病毒 （ 犆犪狌犾犻犳犾狅狑犲狉犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 ， ＣａＭＶ ） 的 ３５Ｓ 终止子 。 ３ ． ４ 　 犖犗犛 终止子 　 狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉狅犳狀狅狆犪犾犻狀犲狊狔狀狋犺犪狊犲犵犲狀犲 来自胭脂碱合成酶基因的终止子 。 ３ ． ５ 犈 ９ 终止子 　 狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉狅犳狉犻犫狌犾狅狊犲 １ ， ５ 犫犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲犮犪狉犫狅狓狔犾犪狊犲狊犿犪犾犾狊狌犫狌狀犻狋 来自豌豆核酮糖 １ ， ５ 二磷酸羧化酶小亚基 （ ｒｉｂｕｌｏｓｅ１ ， ５ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔ ） 基因的 ３′ 端终止序列 。 ３ ． ６ 狆犪狋 基因 　 狆犺狅狊狆犺犻狀狅狋犺狉犻犮犻狀犪犮犲狋狔犾狋狉犪狀狊犱犲狉犪狊犲犵犲狀犲 来自绿产色链霉菌 （ 犛狋狉犲狆狋狅犿犮犲狊狏犻狉犻犱狅犮犺狉狅犿狅犵犲狀犲狊 ）， 编码膦丝菌素乙酰转移酶 （ ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ １ 犌犅 ／ 犜 ３８５０５ — ２０２０ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｄｅｒａｓｅ ， ＰＡＴ ）。 　　 注 ： 狆犪狋 基因对除草剂草甘膦 （ ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ） 具有耐受性 。 ３ ． ７ 犘犻狀 Ⅱ 终止子 狋犲狉犿犻狀犪狋狅狉狅犳狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犻狀犺犻犫犻狋狅狉 Ⅱ 来自马铃薯蛋白酶抑制剂 Ⅱ （ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ⅱ ， 犘犻狀 Ⅱ ） 的终止子 。 ３ ． ８ 犚犫犮犛４ 启动子 　 狆狉狅犿狅狋犲狉狅犳狉犻犫狌犾狅狊犲 １ ， ５ 犫犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲犮犪狉犫狅狓狔犾犪狊犲狊犿犪犾犾狊狌犫狌狀犻狋 １ 犃 来自拟南芥核酮糖 １ ， ５ 二磷酸羧化酶 ／ 加氧酶小亚基 １Ａ （ ｒｉｂｕｌｏｓｅ１ ， ５ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔ１Ａ ， 犚犫犮犛４ ） 编码基因的启动子 。 ３ ． ９ 犇犃犛 ４０２７８５ ′ 边界序列 　 ５ ′犲狀犱犲狏犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犇犃犛 ４０２７８ ＤＡＳ４０２７８ 转化体外源插入片断 ５′ 端与玉米基因组的连接区序列 。 　　 注 ： 该序列包括外源插入片段的部分载体序列和玉米基因组的部分序列 。 ３ ． １０ 犇犘 ３０５４２３３ ′ 边界序列 　 ３ ′犲狀犱犲狏犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犇犘 ３０５４２３ ＤＰ３０５４２３ 转化体外源插入片断 ３′ 端与大豆基因组的连接区序列 。 　　 注 ： 该序列包括外源插入片段的部分载体序列和大豆基因组的部分序列 。 ３ ． １１ 犆犞 １２７５ ′ 边界序列 　 ５ ′犲狀犱犲狏犲狀狋狊狆犲犮犻犳犻犮狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犆犞 １２７ ＣＶ１２７ 转化体外源插入片断 ５＇ 端与大豆基因组的连接区序列 。 　　 注 ： 该序列包括外源插入片段的部分载体序列和大豆基因组的部分序列 。 ３ ． １２ 犆狋 值 　 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱 反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ４ 　 试剂与材料 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯或生化试剂 。 试验用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水的规格 。 ４ ． １ 　 实时荧光 犘犆犚 预混液 采用经验证符合实时荧光 ＰＣＲ 要求的实时荧光 ＰＣＲ 预混液 。 ４ ． ２ 　 ５００ 犿犿狅犾 ／ 犔 乙二胺四乙酸二钠溶液 （ 狆犎 ８ ． ０ ） 称取 １８．６ｇ 乙二胺四乙酸二钠 ， 加入 ７０ｍＬ 水中 ， 并用 ＮａＯＨ 溶液调 ｐＨ 值至 ８．０ ， 加水定容至 １００ｍＬ 。 在 １０３．４ｋＰａ （ １２１℃ ） 条件下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ４ ． ３ 　 １ 犿狅犾 ／ 犔 三羟甲基氨基甲烷  盐溶液 （ 狆犎 ８ ． ０ ） 称取 １２１．１ｇ 三羟甲基氨基甲烷溶解于 ８００ｍＬ 水中 ， 用盐酸调 ｐＨ 值至 ８．０ ， 加水定容至 １０００ｍＬ 。 在 １０３．４ｋＰａ （ １２１℃ ） 条件下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ４ ． ４ 　 犜犈 缓冲液 （ 狆犎 ８ ． ０ ） 分别量取 １０ｍＬ１ｍｏｌ ／ Ｌ 三羟甲基氨基甲烷  盐溶液 （ ４．３ ） 和 ２ｍＬ５００ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙二胺四乙酸二钠溶液 （ ４．２ ）， 加水定容至 １０００ｍＬ 。 在 １０３．４ｋＰａ （ １２１℃ ） 条件下灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８５０５ — ２０２０ ４ ． ５ 　 引物和探针 内源和外源基因或元件检测引物和探针序列见表 １ 。 引物和探针用 ＴＥ 缓冲液或双蒸水稀释 ， 稀 释浓度见表 １ 。 探针的 ５′ 端标记荧光报告基团 （ 如 ＦＡＭ 、 ＨＥＸ 等 ）， ３′ 端标记荧光淬灭基团 （ 如 ＴＡＭＲＡ 、 ＢＨＱ１ 等 ）。 表 １ 　 引物和探针信息表 靶标 引物名称 序列 （ ５′３′ ） 稀释终浓度 ／ （ ｎｍｏｌ ／ Ｌ ） 目的片段 大小 ／ ｂｐ １８ＳｒＲＮＡ 内源基因上游引物 ＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＴ ４００ 下游引物 ＣＧＴＧＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＧＴＡＡＴ ４００ 探针 ＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴ ２００ １３７ ＣａＭＶ３５Ｓ 启动子上游引物 ＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣ ４００ 下游引物 ＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＡＧＧＡＴＡ ４００ 探针 ＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣ ２００ ９５ ＣａＭＶ３５Ｓ 终止子上游引物 ＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＴＣ ４００ 下游引物 ＣＡＡＣＡＣＡＴＧＡＧＣＧＡＡＡＣＣＣＴＡＴＡＡ ４００ 探针 ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴ ２００ １０１ 犖犗犛 终止子上游引物 ＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧ ４００ 下游引物 ＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＡＴＡＴＴＴ ４００ 探针 ＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＣＧ ２００ ９７ 狆犪狋 基因上游引物 ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴ