书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆犆犛犃 ２１ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３８４８８ — ２０２１ 微生物快速测定方法 犚犪狆犻犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅狅狉犵犪狀犻狊犿狊 ２０２１  １２  ３１ 发布 ２０２２  ０７  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本文件按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２０２０ 《 标准化工作导则 　 第 １ 部分 ： 标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中国标准化研究院提出并归口 。 本文件起草单位 ： 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、 中国标准化研究院 、 天津海关工业产品安全技术中心 、 江汉大学 、 北京工商大学 、 武汉旭东食品有限公司 、 北京萨姆伯科技有限公司 、 华测检测认证集团北京有限公司 、 中国农业大学 。 本文件主要起草人 ： 张捷 、 马爱进 、 柳明 、 赵琢 、 彭海 、 畅晓晖 、 张园 、 贾英民 、 高欣 、 杨向莹 、 张惠媛 、 何旭东 、 郝帅 、 李小林 、 董立雅 、 张昊 、 王华 、 陈广全 、 彭彦昆 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８４８８ — ２０２１ 微生物快速测定方法 １ 　 范围 本文件规定了用分子马达法 、 近红外免疫层析法和目标区域测序法快速测定微生物的方法 。 本文件中第一法 ——— 分子马达法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌 （ 犔 ． 犿狅狀狅犮狔狋狅犵犲狀犲狊 ）、 副溶血性弧菌 （ 犞犻犫狉犻狅狆犪狉犪犺犲犿狅犾狔狋犻犮狌狊 ）、 霍乱弧菌 （ 犞犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪犲 ）、 沙门氏菌 （ 犛犪犾犿狅狀犲犾犾犪 ）、 阪崎克罗诺杆菌 （ 阪崎肠杆菌 ）（ 犆狉狅狀狅犫犪犮狋犲狉狊犪犽犪狕犪犽犻犻 ）、 志贺氏菌 （ 犛犺犻犵犲犾犾犪 ）、 甲型肝炎病毒 （ 犎犲狆犪狋犻狋犻狊犃狏犻狉狌狊 ， 犎犃犞 ） 的快速测定 ； 第二法 ——— 近红外免疫层析法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌 、 副溶血性弧菌 、 霍乱弧菌 、 沙门氏菌 、 轮状病毒 （ 犚狅狋犪狏犻狉狌狊 ）、 诺如病毒 （ 犖狅狉狅狏犻狉狌狊 ）、 甲型肝炎病毒的快速测定 ； 第三法 ——— 目标区域测序法适用于食品和生活饮用水中沙门氏菌 、 志贺氏菌 、 金黄色葡萄球菌 （ 犛狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊犪狌狉犲狌狊 ）、 副溶血性弧菌 、 小肠结肠炎耶耳森氏菌 （ 犢犲狉狊犻狀犻犪犲狀狋犲狉狅犮狅犾犻狋犻犮犪 ）、 空肠弯曲菌 （ 犆犪犿狆狔犾狅犫犪犮狋犲狉犼犲犼狌狀犻 ）、 单核细胞增生李斯特氏菌 、 肠出血性大肠杆菌 Ｏ１５７ ： Ｈ７ （ 犈狀狋犲狉狅犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犈 ． 犮狅犾犻 Ｏ１５７ ）、 霍乱弧菌 、 阪崎克罗诺杆菌 （ 阪崎肠杆菌 ）、 创伤弧菌 （ 犞犻犫狉犻狅狏狌犾狀犻犳犻犮狌狊 ） 和溶藻弧菌 （ 犞犻犫狉犻狅犪犾犵犻狀狅犾狔狋犻犮狌狊 ） 的快速测定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。 其中 ， 注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ； 不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 ４ 　 分子马达法 ４ ． １ 　 原理 ＡＴＰ 合成酶属于一种旋转型分子马达 ， 由跨膜质子 （ Ｈ ＋ ） 梯差驱动 ， 其上的 ε 亚基为转子 ， 转子负载越大 ， 分子马达转速越低 、 跨膜转运的质子 （ Ｈ ＋ ） 数量越少 。 在 ＡＴＰ 合成酶的 ε 亚基上连接 ε 亚基抗体  链霉亲和素  生物素  核酸探针 （ 见附录 Ａ 表 Ａ．２ ）， 当探测到目标病原微生物特异性基因序列并与其结合时 ， 分子马达的转速变化可以间接地通过载色体 （ ｃｈｒｏｍａｔｏｐｈｏｒｅ ） 膜外标记的对 ｐＨ 敏感的荧光探针 １ ， ２ 双十六烷基 ３ 甘油  磷酸乙醇胺 （ ＤＨＰＥ ） 来检测 ， 从而实现对目标病原微生物的定性测定 。 ４ ． ２ 　 试剂和材料 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ４ ． ２ ． １ 　 水 ： ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水 。 ４ ． ２ ． ２ 　 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３８４８８ — ２０２１ ４ ． ２ ． ３ 　 ＲＮＡ 提取试剂盒 。 ４ ． ２ ． ４ 　 分子马达检测试剂盒 ： 见表 Ａ．１ 。 ４ ． ２ ． ５ 　 荧光素酶溶液 ： 将荧光素酶 ／ 荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶 ／ 荧光素的棕色玻璃瓶中 ， 盖上瓶塞反复颠倒混匀 ， 不可振荡 。 ４ ． ２ ． ６ 　 异硫氰酸胍溶液 ： ６ｍｏｌ ／ Ｌ 。 ４ ． ２ ． ７ 　 阳性对照 ： 以标准菌株或病毒提取 ＤＮＡ ， 作为阳性对照 。 ４ ． ２ ． ８ 　 阴性对照 ： 以不含目标微生物的样品 ， 提取 ＤＮＡ ， 作为阴性对照 。 ４ ． ３ 　 仪器设备 ４ ． ３ ． １ 　 恒温水浴锅 ： ０℃ ～ １００℃ 。 ４ ． ３ ． ２ 　 涡旋振荡器 。 ４ ． ３ ． ３ 　 离心机 ： １５０００ 犵 。 ４ ． ３ ． ４ 　 移液器 ： 单道 ２０ μ Ｌ ， ５０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ； 多道 ５０ μ Ｌ ～ ２５０ μ Ｌ 。 ４ ． ３ ． ５ 　 电子天平 ， 感量 ０．０１ｇ 。 ４ ． ３ ． ６ 　 荧光光谱仪 ： 配备 ９６ 孔板及相应装置 。 ４ ． ３ ． ７ 　 离心管 ： １．５ｍＬ 。 ４ ． ４ 　 病原菌 ４ ． ４ ． １ 　 操作步骤 ４ ． ４ ． １ ． １ 　 样品制备 、 增菌培养和分离 见附录 Ｂ 。 ４ ． ４ ． １ ． ２ 　 犇犖犃 提取 挑取可疑菌落 ， 用 ＤＮＡ 提取试剂盒进行提取 ， 所得菌体 ＤＮＡ 提取液作为样品待测液 。 制备好的 ＤＮＡ 样品应尽快进行检测 。 若暂时不能进行检测 ， 应置于冰箱中 －２０℃ 保存 ， 使用时置于室温自然解冻 ， 涡旋振荡混匀 。 ４ ． ４ ． １ ． ３ 　 犇犖犃 变性 取 ４．４．１．２ 中的样品待测液 １０ μ Ｌ 分别加入 ６ 个 １．５ｍＬ 离心管 ， 置于恒温水浴锅中 ， 沸水浴中加热 ３ｍｉｎ ， 立刻转移到冰浴中 ， 静置冷却 。 ４ ． ４ ． １ ． ４ 　 配制反应体系 ４ ． ４ ． １ ． ４ ． １ 　 分别取病原菌分子马达探针溶液 （ 见表 Ａ．１ ） ２ μ Ｌ ， 用合成缓冲液 （ 见表 Ａ．１ ） 稀释到一定的倍数 。 取稀释后的分子马达探针溶液 １０ μ Ｌ 分别加入 ４．４．１．３ 的各离心管中 。 ４ ． ４ ． １ ． ４ ． ２ 　 向 ４．４．１．４．１ 的各离心管中加入 ３０ μ Ｌ 启动缓冲液 （ 二磷酸腺苷 ＡＤＰ 和合成缓冲液按体积比 １∶３ 混合配制 ）， 涡旋振荡混匀 ， 立即离心去除管盖内壁上的水珠 ， 放入 ３７℃ 恒温摇床中温育 ３０ｍｉｎ 。 取出离心管后分别加入 ４５０ μ Ｌ１×ＰＢＳ 缓冲液 （ 见表 Ａ．１ ）， 涡旋振荡混匀 ， 形成最终反应体系 。 ４ ． ４ ． １ ． ５ 　 加样与测定 用无菌水代替样品待测液 ， 其他步骤不变制备空白对照 。 用无菌水代替样品待测液 ， 不加入分子马达探针 ， 其他步骤不变制备本底对照 。 将 ４．４．１．４．２ 处理后的最终反应体系 、 空白对照及本底对照分别加入洁净的 ９６ 孔板中 ， 每个反应体系加 ３ 个孔 ， 空白对照和本底对照各加 ３ 个孔 ， 每孔 ５０ μ Ｌ 。 每孔分 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８４８８ — ２０２１ 别加入 ３０ μ Ｌ 荧光素酶溶液 （ １ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ）， 用移液器混匀各孔溶液 。 荧光光谱仪设定激发波长为 ４９６ｎｍ ， 发射波长为 ５１９ｎｍ ， 测定各孔荧光度值 （ ＯＤ 值 ）， 用最终反应体系荧光度值减去本底荧光度值和空白对照荧光度值即为样品的实际荧光度值 。 ４ ． ４ ． ２ 　 结果及判定 ４ ． ４ ． ２ ． １ 　 结果计算 荧光差值按式 （ １ ） 计算 ： Δ 犉 ＝ 犅 － 犅 ０ － 犅 Ｈ ２ Ｏ 犅 － 犅 ０ × １００％ …………………………（ １ ） 　　 式中 ： Δ 犉 ——— 荧光差值 ； 犅 ——— 样品荧光度值 ； 犅 ０ ——— 空白对照荧光度值 ； 犅 Ｈ ２ Ｏ ——— 本底对照荧光度值 。 ４ ． ４ ． ２ ． ２ 　 结果分析 将样品荧光度值绝对值与 Ｈ ２ Ｏ 的空白对照荧光度值绝对值进行单因素方差分析 ， 若差异显著 （ 狆 ＜ ０．０５ ） 则表示检出该基因 。 ４ ． ４ ． ２ ． ３ 　 结果判定 两次样品荧光差值平均值大于 １０％ ， 则结果判定为阳性 ； 两次样品荧光差值平均值小于或等于 １０％ ， 则结果判定为阴性 。 本方法判定为阳性结果的样品 ， 宜参照附录 Ｂ 中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证 。 ４ ． ５ 　 病毒 ４ ． ５ ． １ 　 操作步骤 ４ ． ５ ． １ ． １ 　 提取 见附录 Ｂ 。 ４ ． ５ ． １ ． ２ 　 犚犖