书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３８４７５ — ２０２０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G22 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犿狔犮狅狋狅狓犻狀狊犻狀狆犻犵犿犲狀狋 — 犚犪狆犻犱狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犿犲狋犺狅犱狅犳犮狅犾犾狅犻犱犪犾犵狅犾犱狊狋狉犻狆狋犲狊狋 ２０２０  １１  １９ /G31 /G32 ２０２０  １１  １９ /G33 /G34 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G31 /G32书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国计量大学 、 中国标准化研究院 、 江南大学 、 北京萨姆伯科技有限公司 。 本标准主要起草人 ： 崔海峰 、 叶子弘 、 马爱进 、 刘丽强 、 张明洲 、 俞晓平 、 许益鹏 、 申屠旭萍 、 张雅芬 、 匡华 、 郝帅 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８４７５ — ２０２０ 色素中生物毒素检测胶体金快速定量法 １ 　 范围 本标准规定了用胶体金快速定量法检测天然色素产品中生物毒素的方法 。 本标准适用于基于天然产物提取及发酵制备的天然色素产品中黄曲霉素 Ｂ １ 、 桔青霉素 、 玉米赤霉烯酮 、 呕吐毒素的快速定量检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ５４９１ 　 粮食 、 油料检验 　 扦样 、 分样法 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 原理 试样提取液中的生物毒素在层析过程中与检测试剂条中胶体金微粒标记的特异性抗体竞争结合并发生呈色反应 ， 颜色深浅与试样中生物毒素含量相关 。 用读数仪检定检测条上检测线和质控线颜色深浅 ， 根据颜色深浅和读数仪内置曲线自动计算出试样中生物毒素含量 。 ４ 　 试剂或材料 除另有说明外 ， 所用试剂均为分析纯 。 ４ ． １ 　 水 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 二级水 。 ４ ． ２ 　 黄曲霉毒素 犅 １ 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． ３ 　 桔青霉素 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． ４ 　 玉米赤霉烯酮 纯度 ≥ ９８％ 。 ４ ． ５ 　 呕吐毒素 纯度 ≥ ９８％ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３８４７５ — ２０２０ ４ ． ６ 　 苯 ＋ 乙腈混合液 量取 ９８．０ｍＬ 苯 ， 加 ２．０ｍＬ 乙腈 ， 混匀 。 ４ ． ７ 　 稀释缓冲液 称取 ２．４２２８ｇ 三羟甲基氨基甲烷 ， 加水溶解 ， 调 ｐＨ＝８．０ ； 加入 ９．０ｇ 氯化钠 、 ５ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ１００ ， 用水定容至 １０００ｍＬ ； 或采用商品化的同类产品 。 ４ ． ８ 　 ７０ ％ （ 体积分数 ） 甲醇溶液提取液 取 ７０．０ｍＬ 的甲醇加水 ３０．０ｍＬ ， 混匀 。 ４ ． ９ 　 犘犅犛 缓冲溶液 称取 ８．０ｇ 氯化钠 、 １．２ｇ 磷酸氢二钠 、 ０．２ｇ 磷酸二氢钾 、 ０．２ｇ 氯化钾 ， 用水溶解 ， 调节 ｐＨ 至 ７．０ ， 用 水定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． １０ 　 ０ ． １ ％ （ 体积分数 ） 吐温 ２０ 犘犅犛 溶液 移取 １ｍＬ 吐温 ２０ ， 以 ＰＢＳ 缓冲溶液定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． １１ 　 ０ ． １ ％ （ 体积分数 ） 磷酸溶液 准确移取 １ｍＬ 磷酸 ， 加水定容至 １０００ｍＬ 。 ４ ． １２ 　 ０ ． １ 犿犵 ／ 犔 的生物毒素标准储备液 分别准确称取一定量的生物毒素标准品 ， 用苯 ＋ 乙腈 （ ９８∶２ ） 溶液溶解 ， 容量瓶定容至 １０ｍＬ ， 配制 ０．１ｍｇ ／ Ｌ 的生物毒素标准储备液 ， 保存于 ４℃ 备用 ， 可保存 １ 年 。 ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 天平 ： 精度 ０．０１ｇ 和 ０．０１ｍｇ 。 ５ ． ２ 　 粉碎机 ： 转速不低于 ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ ． ３ 　 离心机 ： 转速不低于 ３０００× 犵 。 ５ ． ４ 　 涡旋振荡器 。 ５ ． ５ 　 读数仪 ： 可测定并显示胶体金免疫层析试纸条的检测结果 。 ５ ． ６ 　 胶体金免疫层析检测试纸条 ： 性能要求见附录 Ａ 。 ５ ． ７ 　 微量移液器 。 ５ ． ８ 　 免疫亲和柱 ： 柱体积规格 １ｍＬ 或 ３ｍＬ ， 柱容量不低于 ２００ｎｇ ， 或等效柱 。 ６ 　 样品制备 ６ ． １ 　 试样取样 按照 ＧＢ ／ Ｔ５４９１ 执行 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８４７５ — ２０２０ ６ ． ２ 　 试样制备 ６ ． ２ ． １ 　 固体样品 天平称取有代表性的固体或样品 ５００ｇ ， 其中 ３００ｇ 用粉碎机粉碎至全部通过 ２０ 目筛 ， 混匀 ， 分两份密封冷冻保存 。 取一份保存样品准确称取 ２．０ｇ 试样于 １０ｍＬ 具塞锥形瓶中 ， 加入 ２０．０ｍＬ７０％ 甲醇溶液提取液 ， 密闭 ， 用涡旋振荡器振荡 ２ｍｉｎ ～ ３ｍｉｎ ， 静置后用滤纸过滤 ， 或取 １．５ｍＬ 混合液于离心管中 ， 用离心机离心 １ｍｉｎ 。 取滤液或离心后上清液 １００ μ Ｌ 于另一离心管中 ， 加 ９００ μ Ｌ 于稀释缓冲液 ， 充分混匀待测 。 如样品为特殊材料 ， 需将稀释后的混合液用针头过滤器过滤 ， 即为待测液 。 ６ ． ２ ． ２ 　 液体样品 液体待测样品用均质器 ， 处理不少于 ２ｍｉｎ ， 充分混匀后 ， 用微量移液器分别吸取 １．０ｍＬ 加入 ２ 个 ２．０ｍＬ 离心管中 ， 一份密封冷冻保存 ， 一份用于检测 。 从待测离心管中吸取 ２００ μ Ｌ 离心液体样品于另一离心管中 ， 加入 １．８ｍＬ 稀释缓冲液 ， 充分混匀待测 。 ６ ． ２ ． ３ 　 净化 将免疫亲和柱连接在 １０ｍＬ 玻璃针筒下 ， 准确移取 １０．０ｍＬ 上述样品滤液过免疫亲和柱 ， 以 １ 滴 ／ ｓ ～ ２ 滴 ／ ｓ 的流速全部通过亲和柱 ； 加入 １０ｍＬ０．１％ 吐温 ２０ＰＢＳ 溶液 ， 以 １ 滴 ／ ｓ ～ ２ 滴 ／ ｓ 的流速淋洗柱子 ， 直至空气进入到亲和柱中 ， 弃去全部流出液 。 准确加入 １．０ｍＬ 洗脱液进行洗脱 ， 洗脱流速为 １ 滴 ／ ｓ ～ ２ 滴 ／ ｓ 。 收集全部洗脱液于离心管中备用 。 注 ： 净化处理仅针对红曲红等对胶体金反应结果产生严重背景干扰的色素产品 。 ７ 　 测定 ７ ． １ 　 低温保存的检测试纸条取出后 ， 室温放置 ２０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ２ 　 胶体金试剂条 ： 将试纸条浸入含 ３００ μ Ｌ ～ ５００ μ Ｌ 待测溶液的离心管中 ， 室温孵育 ５ｍｉｎ 。 ７ ． ３ 　 胶体金检测卡 ： 将 ６０ μ Ｌ ～ ８０ μ Ｌ 待测溶液加入到检测孔中 ， 室温孵育 ５ｍｉｎ 。 ７ ． ４ 　 宜选择胶体金检测试纸条或检测卡生产厂家的读数仪配套使用 。 ８ 　 结果分析 ８ ． １ 　 反应结束后 ， 取出胶体金免疫层析检测试纸条或检测卡观察 Ｃ 线 （ 质控线 ） 和 Ｔ 线 （ 检测线 ） 的显色情况 。 若出现 Ｃ 线不出现 ， 或 Ｃ 线出现但弥散或严重不均匀 ， 或 Ｃ 线出现但 Ｔ 线弥散或严重不均匀 ， 均视为无效检测 。 ８ ． ２ 　 调整读数仪参数 ， 固定好胶体金检测试纸条或检测卡 ， 对目标毒素进行检测 ， 测定需要在 ２ｍｉｎ 内完成 ， 重复测定 ３ 次 ， 读数仪根据内置拟合曲线自动计算并显示样品中相应生物毒素的含量 ， 单位为微克每千克 （ μ ｇ ／ ｋｇ ） 或微克每升 （ μ ｇ ／ Ｌ ）。 ８ ． ３ 　 在相应生物毒素的检测范围内 ， 基于阴性对照样品 ， 设置空白样品添加的不同浓度梯度 ， 其中黄曲霉毒素 Ｂ １ 浓度范围为 ２ μ ｇ ／ ｋｇ ～ １２８ μ ｇ ／ ｋｇ ； 桔青霉素浓度范围为 ４０ μ ｇ ／ ｋｇ ～ ６４０ μ ｇ ／ ｋｇ ； 呕吐毒素浓度范围为 ３００ μ ｇ ／ ｋｇ ～ １４４００ μ ｇ ／ ｋｇ ； 玉米赤霉烯酮浓度范围为 ４０ μ ｇ ／ ｋｇ ～ １９２０ μ ｇ ／ ｋｇ 。 基于标准样品浓度值与代表 Ｔ 线强度光密度值的积分面积检测数据 ， 采用四参数 ｌｏｇｉｓｔｉｃ 拟合算法建立标准曲线 ， 拟合程度 犚 ２ 值应在 ０．９９ 以上 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３８４７５ — ２０２０ ９ 　 重复性 在重复性条件下获得的 ２ 次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 ２０％ 。 １０ 　 其他 本方法检出限黄曲霉毒素 Ｂ １ ２．０ μ ｇ ／ ｋｇ ， 桔青霉素 ４０ μ ｇ ／ ｋｇ ， 玉米赤霉烯酮 ６０ μ ｇ ／ ｋｇ ， 呕吐毒素 ５００ μ ｇ ／ ｋｇ 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ３８４７５ — ２０２０ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 胶体金快速检测试