书 书 书犐犆犛 ５９ ． １４０ ． ３０ 犢 ４６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３８４２１ — ２０１９ /G21 /G22 　 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 　 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G24 /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G33 /G34 （ 犘犆犚 ） /G27 /G28 /G35 /G36 犉狌狉 — 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狀犻犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾 — 犙狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狉犲犪犾狋犻犿犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 （ 犘犆犚 ） 犿犲狋犺狅犱狊 ２０１９  １２  ３１ /G37 /G38 ２０２０  ０７  ０１ /G29 /G39 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G37 /G38书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国轻工业联合会提出 。 本标准由全国皮革工业标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２５２ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 广州检验检测认证集团有限公司 、 国家皮革质量监督检验中心 （ 浙江 ）、 深圳华大基因科技服务有限公司 、 浙江方圆检测集团股份有限公司 、 中国皮革制鞋研究院有限公司 、 陕西科技大学 、 中国计量大学 、 东莞市惟思德科技发展有限公司 。 本标准主要起草人 ： 覃芳芳 、 黄新霞 、 孙海陆 、 陈宗良 、 王学川 、 冯爱明 、 张弛 、 孙霞 、 赵洋 、 章文福 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８４２１ — ２０１９ 毛皮 　 源性成分检测 　 实时荧光定性聚合酶链式反应 （ 犘犆犚 ） 检测方法 １ 　 范围 本标准规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光 ＰＣＲ 检测方法 。 本标准适用于八种天然毛皮 （ 水貂 、 兔 、 貉子 、 浣熊 、 马 、 牛 、 山羊和绵羊 ） 的源性成分定性检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．２ 　 转基因产品检测 　 实验室技术要求 ＧＢ ／ Ｔ２１１０２ — ２００７ 　 动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法 　 实时荧光 ＰＣＲ 方法 ＧＢ ／ Ｔ２５１６５ — ２０１０ 　 明胶中牛 、 羊 、 猪源性成分的定性检测方法 　 实时荧光 ＰＣＲ 法 ３ 　 术语和定义 、 缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 实时荧光聚合酶链式反应 　 狉犲犪犾狋犻犿犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团 ， 利用荧光信号的积累 ， 实时监控整个 ＰＣＲ 进程 ， 并通过扩增曲线对未知模板进行定性分析的方法 。 注 ： 改写 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．４ — ２０１８ ， 定义 ３．１．２ 。 ３ ． １ ． ２ 犆狋 值 　 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ［ ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．４ — ２０１８ ， 定义 ３．１．５ ］ ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＤＴＴ ： 二硫苏糖醇 （ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ） ｄＮＴＰｓ ： 脱氧核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＦＡＭ ： ６ 羧基荧光素 （ ６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ） Ｎａ ２ ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸钠盐 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＤＳ ： 十二烷基硫酸钠 （ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） １ 犌犅 ／ 犜 ３８４２１ — ２０１９ ＴＡＭＲＡ ： ６ 羧基四甲基若丹明 （ ６ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ） 犜犪狇 酶 ： ＤＮＡ 聚合酶 （ 犜犪狇 ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） Ｔｒｉｓ ： 三羟甲基氨基甲烷 ［（ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ］ １８ＳｒＲＮＡ ： 真核生物核糖体小亚基 １８Ｓ 基因 （ １８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ ） ４ 　 原理 提取动物毛皮试样中的 ＤＮＡ ， 针对水貂 、 兔 、 貉子 、 浣熊 、 马 、 牛 、 山羊 、 绵羊物种特异性的内源基因序列设计引物 ， 通过特异性引物和标记荧光物质探针 ， 对动物源性的 ＤＮＡ 进行实时荧光 ＰＣＲ 扩增 ， 根据 ＰＣＲ 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定 ， 实现对毛皮中动物源性成分的定性分析 。 ５ 　 试剂和材料 ５ ． １ 　 一般规定 ： 除非另有说明 ， 所用试剂均为分析纯 ， 试验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水的规定 。 ５ ． ２ 　 灭菌水 。 ５ ． ３ 　 氢氧化钠 （ ＮａＯＨ ）。 ５ ． ４ 　 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓ ）。 ５ ． ５ 　 盐酸 （ ＨＣｌ ）。 ５ ． ６ 　 乙二胺四乙酸钠盐 （ Ｎａ ２ ＥＤＴＡ ）。 ５ ． ７ 　 十二烷基硫酸钠 （ ＳＤＳ ）。 ５ ． ８ 　 氯化钠 。 ５ ． ９ 　 乙酸钠 。 ５ ． １０ 　 冰乙酸 。 ５ ． １１ 　 蛋白酶 Ｋ （ ２０ｍｇ ／ ｍＬ ）， －２０℃ 条件下保存 。 ５ ． １２ 　 二硫苏糖醇 （ ＤＴＴ ）。 ５ ． １３ 　 苯酚 （ Ｔｒｉｓ 平衡酚 ， ｐＨ７．０ ～ ８．０ ）。 ５ ． １４ 　 三氯甲烷 。 ５ ． １５ 　 异丙醇 。 ５ ． １６ 　 无水乙醇 。 ５ ． １７ 　 乙醇溶液 （ 体积分数 ７５％ ）： 取 ７５ｍＬ 无水乙醇 （ ５．１６ ）， 加水定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． １８ 　 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ＝７．６ 和 ｐＨ＝８．０ ）： 称取 １２１．１ｇ 三羟甲基氨基甲烷 （ ５．４ ）， 溶于 ８００ｍＬ 水中 ， 冷却至室温 ， 用盐酸 （ ５．５ ） 调节 ｐＨ 至所需值 ， 加水定容至 １Ｌ ， １２１℃ 条件下高压灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ５ ． １９ 　 Ｎａ ２ ＥＤＴＡ 溶液 （ ０．５ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ＝８．０ ）： 称取 １８６．１ｇＮａ ２ ＥＤＴＡ （ ５．６ ）， 溶于 ７００ｍＬ 水中 ， 用氢氧化钠 （ ５．３ ） 调节 ｐＨ 至 ８．０ ， 加水定容至 １Ｌ ， １２１℃ 条件下高压灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ５ ． ２０ 　 氢氧化钠溶液 （ ５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ４０ｇ 氢氧化钠 （ ５．３ ） 溶于 １００ｍＬ 水中 ， 冷却后 ， 加水定容至 ２００ｍＬ 。 ５ ． ２１ 　 氯化钠溶液 （ ５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ５８．４４ｇ 氯化钠 （ ５．８ ） 溶于 １００ｍＬ 水中 ， 加水定容至 ２００ｍＬ 。 ５ ． ２２ 　 ＳＤＳ 裂解缓冲液 ： 在 ５００ｍＬ 水中分别加入 １００ｍＬｐＨ 为 ７．６ 的 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 （ ５．１８ ）、 １００ｍＬＮａ ２ ＥＤＴＡ 溶液 （ ５．１９ ）、 １００ｍＬ 氯化钠溶液 （ ５．２１ ） 和 ５ｇＳＤＳ （ ５．７ ）， 完全溶解后加水定容至 １Ｌ ， １２１℃ 条件下高压灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ５ ． ２３ 　 乙酸钠溶液 （ ３ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ＝５．２ ）： 称取 ４９．２１ｇ 乙酸钠 （ ５．９ ）， 溶于 １２０ｍＬ 水中 ， 用冰乙酸 （ ５．１０ ） 调节 ｐＨ 至 ５．２ ， 加水定容至 ２００ｍＬ 。 ５ ． ２４ 　 ＴＥ 缓冲液 ： 在 ８００ｍＬ 水中分别加入 １０ｍＬｐＨ 为 ８．０ 的 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 （ ５．１８ ） 和 ２ｍＬＮａ ２ ＥＤＴＡ 溶液 （ ５．１９ ）， 加水定容至 １Ｌ ， １２１℃ 条件下高压灭菌 ２０ｍｉｎ 。 ５ ． ２５ 　 ＤＮＡ 吸附柱 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８４２１ — ２０１９ ５ ． ２６ 　 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 ５ ． ２７ 　 实时荧光 ＰＣＲ 试剂盒 ， 包括 犜犪狇 酶 、 ｄＮＴＰｓ 、 ＰＣＲ 体系缓冲液等 ， 按试剂盒要求保存 。 ５ ． ２８ 　 水貂 、 兔 、 貉子 、 浣熊 、 马 、 牛 、 山羊和绵羊基因组 ＤＮＡ ， ０℃ ～ ４℃ 条件下保存 。 ５ ． ２９ 　 引物和探针 ： 所需引物和探针信息见表 １ ， －２０℃ 条件下保存 。 表 １ 　 引物和探针信息 引物名称 引物和探针序列 （ ５′３′ ） 目标基因 内参引物探针 ａ 正向 反向 探针 ＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＴ ＣＧＴＧ