书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ４０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３８１６３ — ２０１９ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D  /G2E /G2F /G30 /G2D /G31 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犾犾犲狉犵犲狀犻犮狆狉狅狋犲犻狀 — 犔犆犕犛 ／ 犕犛犿犲狋犺狅犱 ２０１９  １０  １８ /G32 /G33 ２０１９  １０  １８ /G34 /G35 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G32 /G33书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 、 辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心 。 本标准主要起草人 ： 陈颖 、 古淑青 、 邓晓军 、 张九凯 、 郑秋月 、 王娉 、 黄文胜 、 韩建勋 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８１６３ — ２０１９ 常见过敏蛋白的测定液相色谱  串联质谱法 １ 　 范围 本标准规定了固态食品中牛奶 、 鸡蛋 、 大豆 、 花生 、 榛子 、 杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱  串联质谱检测方法 。 本标准适用于含小麦粉 、 燕麦粉 、 腰果 、 可可粉等固态食品基质中牛奶 、 鸡蛋 、 大豆 、 花生 、 榛子 、 杏仁和核桃过敏蛋白的液相色谱  串联质谱测定和确证 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 、 缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 特征肽 　 犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狆犲狆狋犻犱犲 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶消化产物中发现 、 其氨基酸序列具有专属性的多肽 。 ３ ． １ ． ２ 食物过敏 　 犳狅狅犱犪犾犾犲狉犵狔 免疫机制介导的食物免疫反应不良反应 ， 即食物蛋白引起的异常或过强的免疫反应 。 　　 注 ： 免疫反应可由 ＩｇＥ 或非 ＩｇＥ 介导 。 表现为一疾病群 ， 症状累及皮肤 、 呼吸 、 消化 、 心血管等系统 。 ３ ． １ ． ３ 过敏原 　 犪犾犾犲狉犵犲狀 能够引起机体免疫系统异常反应的成分 。 ３ ． １ ． ４ 过敏蛋白 　 犪犾犾犲狉犵犲狀狆狉狅狋犲犻狀 能够引起机体免疫系统异常反应的成分中的蛋白质 。 ３ ． １ ． ５ 肽 　 狆犲狆狋犻犱犲 两个或两个以上的氨基酸脱水缩合形成的有机化合物 。 ３ ． １ ． ６ 胰蛋白酶 　 狋狉狔狆狊犻狀 从动物胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶 ， 能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断 ， 特 １ 犌犅 ／ 犜 ３８１６３ — ２０１９ 异性较强 。 ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＴＴ ： 二硫苏糖醇 （ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ） ＩＡＡ ： 碘代乙酰胺 （ ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ ） ＬＣＭＳ ／ ＭＳ ： 液相色谱  串联质谱法 （ ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ） ＭＲＭ ： 多反应监测 （ ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ） Ｔｒｉｓ ： 三羟甲基氨基甲烷 ［ ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ］ ４ 　 原理 利用质谱技术结合蛋白质组学软件挖掘能够鉴别区分目标食品过敏原特征肽段 。 通过构建的特征肽段的质谱信息 ， 对被测样品蛋白酶解后的多肽混合物进行定向监测 ， 实现对食品过敏原的定性检测 。 质谱中特征肽段的响应峰面积与过敏原的含量呈线性关系 ， 将质谱响应峰面积与过敏原含量建立标准曲线 ， 以肽段的谱峰面积代表过敏原的实际量 ， 通过标准曲线计算得到被测食品过敏原含量 。 ５ 　 主要试剂 除非有特殊说明 ， 仅使用分析纯试剂和符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ５ ． １ 　 碳酸氢铵 （ ＮＨ ４ ＨＣＯ ３ ）。 ５ ． ２ 　 二硫苏糖醇 （ Ｃ ４ Ｈ １０ Ｏ ２ Ｓ ２ ， ＤＴＴ ）。 ５ ． ３ 　 碘代乙酰胺 （ ＩＣＨ ２ ＣＯＮＨ ２ ， ＩＡＡ ）。 ５ ． ４ 　 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｃ ４ Ｈ １１ ＮＯ ３ ， Ｔｒｉｓ ）。 ５ ． ５ 　 盐酸 。 ５ ． ６ 　 磷酸 。 ５ ． ７ 　 乙酸 （ ＣＨ ３ ＣＯＯＨ ）： 色谱纯 。 ５ ． ８ 　 甲酸 （ ＨＣＯＯＨ ）： 色谱纯 。 ５ ． ９ 　 乙腈 （ ＣＨ ３ ＣＮ ）： 色谱纯 。 ５ ． １０ 　 碳酸氢铵溶液 （ ５００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ３．９５ｇ 碳酸氢铵 ， 用水溶解后定容至 １００ｍＬ 。 ５ ． １１ 　 碳酸氢铵溶液 （ ５０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ３．９５ｇ 碳酸氢铵 ， 用水溶解后定容至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １２ 　 二硫苏糖醇 （ ５００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ０．７７１ｇ 二硫苏糖醇 ， 用 ５００ｍｍｏｌ ／ Ｌ 碳酸氢铵溶液溶解后定容至 １０ｍＬ 。 ４℃ 冷藏可保存一个月 。 ５ ． １３ 　 碘代乙酰胺溶液 （ ５００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ０．９２５ｇ 碘代乙酰胺 ， 用 ５００ｍｍｏｌ ／ Ｌ 碳酸氢铵溶液溶解后定容至 １０ｍＬ 。 ４℃ 避光冷藏保存一个月 。 ５ ． １４ 　 ＴｒｉｓＨＣｌ 溶液 （ ４０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ２．４２ｇＴｒｉｓ ， 溶解于 ８００ｍＬ 水中 ， 用 １０％ 盐酸调节 ｐＨ 至 ８．０±０．１ ， 用水定容至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １５ 　 考马斯亮蓝试剂 ： 称取 １００ｍｇ 考马斯亮蓝 Ｇ２５０ 溶于 ５０ｍＬ９５％ 乙醇 ， 加入 １００ｍＬ８５％ 的磷酸 ， 用蒸馏水补充至 ２００ｍＬ 。 ５ ． １６ 　 甲酸的水溶液 （ ０．１％ ， 体积分数 ）： 准确移取 １．０ｍＬ 甲酸 ， 用水定容至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １７ 　 甲酸的乙腈溶液 （ ０．１％ ， 体积分数 ）： 准确移取 １．０ｍＬ 甲酸 ， 用乙腈定容至 １０００ｍＬ 。 ５ ． １８ 　 胰蛋白酶溶液 ： １００ μ ｇ 胰蛋白酶 （ 活力大于 ４０００Ｕ ／ ｍｇ 蛋白质 ）， 用 １００ μ Ｌ１％ 乙酸溶液溶解 。 溶液于 －２０℃ 可保存 ６ 个月 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８１６３ — ２０１９ ６ 　 主要仪器设备 ６ ． １ 　 液相色谱  串联质谱仪 ： 配有电喷雾离子 （ ＥＳＩ ） 源的三重四级杆质谱仪 。 ６ ． ２ 　 分析天平 ： 感量为 ０．０１ｇ 、 ０．００１ｇ 、 ０．１ｇ 。 ６ ． ３ 　 恒温水浴锅 。 ６ ． ４ 　 离心机 ： 转速不低于 ２６８３ 犵 。 ６ ． ５ 　 超滤离心管 （ １０ｋＤ 截止膜 ）。 ６ ． ６ 　 注射器和 ０．２２ μ ｍ 水系滤膜 （ 聚醚砜滤膜 ）。 ６ ． ７ 　 涡旋混匀仪 。 ６ ． ８ 　 ｐＨ 计 ： 测量精度为 ０．０１ 。 ６ ． ９ 　 微量移液器 ： ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ， ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ６ ． １０ 　 组织研磨器 。 ６ ． １１ 　 具塞离心管 。 ６ ． １２ 　 旋转蒸发仪 。 ６ ． １３ 　 分光光度计 。 ７ ． １ 　 试样制备 ７ ． １ 　 标准工作液制备 ７ ． １ ． １ 　 过敏原标准品 ： 榛子 、 核桃 、 杏仁 、 大豆 、 花生 、 全脂奶粉和全蛋粉 ， 或等效商业化标准品 。 ７ ． １ ． ２ 　 食品基质标准品 ： 小麦粉 （ 饼干基质 ）、 腰果 （ 坚果基质 ）、 燕麦粉 （ 早餐谷物基质 ）、 可可粉 （ 巧克力基质 ）（ 以上基质均无 ７．１．１ 中提到的 ７ 种过敏原 ）， 或等效商业化标准品 。 ７ ． １ ． ３ 　 样品制备 ： 称取每种过敏原标准品和食品基质标准品 ５００ｇ±０．１ｇ ， 采用粉碎机粉碎后 ， 再将其研磨成细粉状 ， 过 ５０ 目筛 ， 装入洁净盛样容器内 ， 密封并标明标记 ， 备用 。 ７ ． １ ． ４ 　 标准储备液 ： 分别准确称取 １ｇ （ ±０．００５ｇ ）（ 精确至 ０．００１ｇ ） 过敏原标准品和食品基质 （ ７ 种过敏原分别配制 ４ 种基质 ）， 充分混匀后加入 ＴｒｉｓＨＣｌ 溶液 ， 定容至 ２０ｍＬ 。 震荡均匀使试样完全溶解 ， 置于水浴锅 ６０℃ 加热振荡提取 ３ｈ 。 提取液以 １３８００ 犵 高速离心 ５ｍｉｎ ， 上清液过低蛋白质吸附的 ０．２２ μ ｍ 聚醚砜滤膜后 ， 用 Ｂ