书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ４０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３８０８６ — ２０１９ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F 犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀 （ 犕犜 ） 犻狀犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾狊犪犿狆犾犲狊 ２０１９  １０  １８ /G30 /G31 ２０１９  １０  １８ /G32 /G33 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G30 /G31书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ３８７ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 国家农业标准化监测与研究中心 （ 黑龙江 ）、 深圳市计量质量检测研究院 、 上海市计量测试技术研究院 、 成都大学四川抗菌素工业研究所 、 吉林省检验检疫局技术中心 、 哈尔滨商业大学食品学院 、 哈尔滨春源生物科技开发有限公司 。 本标准主要起草人 ： 王志强 、 王韦达 、 董珊 、 周婕 、 杜业刚 、 李兰英 、 杨晨 、 容会 、 张根生 、 张福源 、 吴楠 、 彭丽萍 、 王世琨 、 姜雯 、 刘文超 、 孔鲁裔 、 牟钰 、 徐凤霞 、 王海宽 、 李碧芳 、 杨俊 、 李意 、 刘奕雄 、 杨国武 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３８０８６ — ２０１９ 生物样品中金属硫蛋白含量的测定 １ 　 范围 本标准规定了生物样品中兔源金属硫蛋白 Ⅰ 型和 Ⅱ 型 （ ＭＴ Ⅰ 和 ＭＴ Ⅱ ） 测定的液相色谱  串联质谱法 。 本标准适用于生物制剂或生物提取物等生物样品中兔源金属硫蛋白 Ⅰ 型和 Ⅱ 型总含量的测定 。 本方法的检出限为 ６．２ｍｇ ／ ｋｇ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 术语和定义 、 缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 　 特征肽段 　 狊狆犲犮犻犳犻犮狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲 唯一在靶蛋白的胰蛋白酶水解产物中发现 、 其氨基酸序列具有专属性的多肽 。 ３ ． １ ． ２ 　 金属硫蛋白 　 犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀 一类富含半胱氨酸且具有高度结合金属能力的低相对分子质量蛋白质 。 ３ ． １ ． ３ 　 金属硫蛋白 Ⅰ 型和 Ⅱ 型 　 犿犲狋犪犾犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀 Ⅰ 犪狀犱 Ⅱ 在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在 ， 尤以肝 、 肾细胞为主 ， 而且参加其功能调节的一类蛋白质 。 ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＴＴ ： 二硫苏糖醇 （ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ） ＩＡＡ ： 碘代乙酰胺 （ ２Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ ） ＭＴ ： 金属硫蛋白 （ Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ） ４ 　 原理 试样经胰蛋白酶酶切后产生特征肽段 ， 用液相色谱  串联质谱法测定试样中特征肽段的含量 ， 按照兔源 ＭＴ Ⅰ 和 ＭＴ Ⅱ 平均相对分子质量与特征肽段的相对分子质量比值为 ６．１６ ， 计算出试样中 ＭＴ Ⅰ １ 犌犅 ／ 犜 ３８０８６ — ２０１９ 和 ＭＴ Ⅱ 的总含量 。 ５ 　 试剂 试验用水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中规定的一级水 。 ５ ． １ 　 碳酸氢铵 （ ＮＨ ４ ＨＣＯ ３ ）： 分析纯 。 ５ ． ２ 　 二硫苏糖醇 （ Ｃ ４ Ｈ １０ Ｏ ２ Ｓ ２ ）： 生化级 。 ５ ． ３ 　 碘代乙酰胺 （ ＩＣＨ ２ ＣＯＮＨ ２ ）： 生化级 。 ５ ． ４ 　 胰蛋白酶 ： 测序级 ， 活力大于 １００００ＢＡＥＥＵｎｉｔ ／ ｍｇ （ ＢＡＥＥ 是测定胰蛋白酶活性的底物 ）， －１８℃ 冷冻保存 。 ５ ． ５ 　 甲酸 （ ＨＣＯＯＨ ）： 色谱纯 。 ５ ． ６ 　 乙腈 （ ＣＨ ３ ＣＮ ）： 色谱纯 。 ５ ． ７ 　 碳酸氢铵溶液 （ １００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ０．３９５ｇ 碳酸氢铵 ， 用水溶解后定容至 ５０ｍＬ 。 ５ ． ８ 　 二硫苏糖醇溶液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 １．５４２ｇ 二硫苏糖醇 ， 用碳酸氢铵溶液溶解后定容至 １０ｍＬ 。 ５ ． ９ 　 碘代乙酰胺溶液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 １．８５０ｇ 碘代乙酰胺 ， 用碳酸氢铵溶液溶解后定容至 １０ｍＬ 。 ５ ． １０ 　 胰蛋白酶溶液 （ ２００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 移取 ２０ μ ｇ 胰蛋白酶用 １００ μ Ｌ 碳酸氢铵溶液溶解 。 ５ ． １１ 　 甲酸溶液 （ ０．１％ ， 体积分数 ）： 移取 １．０ｍＬ 甲酸 ， 用水定容至 １０００ｍＬ 。 ６ 　 仪器设备及器具 ６ ． １ 　 液相色谱  串联质谱仪 ： 配电喷雾离子源 。 ６ ． ２ 　 蛋白超滤管 ： ５０００Ｄａ ～ １００００Ｄａ （ １Ｄａ ≈ １．６６×１０ －２７ ｋｇ ）。 ６ ． ３ 　 蛋白低吸附离心管 ： １．５ｍＬ 。 ６ ． ４ 　 天平 ： 感量 ０．０１ｇ 、 ０．００００１ｇ 。 ６ ． ５ 　 涡旋混合器 。 ６ ． ６ 　 微量移液器 ： １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ６ ． ７ 　 高速冷冻离心机 ： 最高转速不低于 １４０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ６ ． ８ 　 恒温水浴锅 ： ３７℃ 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 特征肽段合成 序列 ＣＡＱＧＣＩＣＫ 为合成肽段 ， 经脱盐纯化工艺 ， 其中的半胱氨酸是由碘代乙酰胺试剂进行了烷基 化修饰 ， 标记为 ［ ＣＡＭ ］。 合成的特征肽段物质信息见附录 Ａ 。 特征肽段 －１８℃ 冷冻保存 。 ７ ． ２ 　 特征肽段溶液配制 特征肽段储备溶液 ： 准确称取肽段 ０．００２０ｇ 溶于 １．０ｍＬ 碳酸氢铵溶液中 ， 制备成 ２．０ μ ｇ ／ μ Ｌ 储备 液 ， －１８℃ 冷冻保存 ， 有效期 １ 个月 。 标准工作溶液 ： 用碳酸氢铵溶液稀释上述特征肽段储备溶液 ， 配制成 １６０ μ Ｌ 中含特征肽段质量为 ０．４ μ ｇ 、 ０．６ μ ｇ 、 ０．８ μ ｇ 、 １．０ μ ｇ 、 １．２ μ ｇ 、 １．４ μ ｇ 、 １．６ μ ｇ 、 １．８ μ ｇ 和 ２．０ μ ｇ 的工作溶液 ， 现用现配 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３８０８６ — ２０１９ ７ ． ３ 　 测定 ７ ． ３ ． １ 　 试样制备 称取 ０．００２ｇ （ 精确至 ０．０００１ｇ ） 试样 ， 置于 １．５ｍＬ 低吸附离心管中 ， 用 １ｍＬ 碳酸氢铵溶液溶解 ， 混匀 。 移取 １２５ μ Ｌ 溶液转移至另一低吸附离心管中 ， 加入 ８７５ μ Ｌ 碳酸氢铵溶液 ， 涡旋混匀 ， 待酶解 。 ７ ． ３ ． ２ 　 试样酶解 取上述试样 ４０ μ Ｌ 置于 １．５ｍＬ 低吸附离心管中 ， 依次加 ６０ μ Ｌ 碳酸氢铵溶液 ， ４ μ ＬＤＴＴ 溶液 ， 混匀后 ３７℃ 恒温水浴 １ｈ ； 冷却至室温 ， 加入 ２０ μ ＬＩＡＡ 溶液 ， 避光静置 ３０ｍｉｎ ， 对半胱氨酸进行烷基化修饰 ； 转移全部溶液至预先用碳酸氢铵溶液润湿的蛋白超滤管中 ， １４０００ｒ ／ ｍｉｎ４℃ 离心 ３０ｍｉｎ ； 加入 １００ μ Ｌ 碳酸氢铵溶液洗膜 ， １４０００ｒ ／ ｍｉｎ４℃ 离心 ３０ｍｉｎ ， 再重复两次 ； 加入 １００ μ Ｌ 碳酸氢铵溶液于超滤管中 ， 再加入 １０ μ Ｌ 胰蛋白酶溶液 ， 混匀后 ３７℃ 恒温水浴酶解 １２ｈ ～ １６ｈ ； 将酶反应物 １４０００ｒ ／ ｍｉｎ４℃ 离心洗脱 ， 再加入 ５０ μ Ｌ 碳酸氢铵溶液洗脱 ， 收集两次含特征肽段的洗脱液混匀待测 。 ７ ． ３ ． ３ 　 仪器参考条件 ７ ． ３ ． ３ ． １ 　 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下所示 ： ａ ） 　 色谱柱 ： Ｃ １８ 柱 （ ２．１ｍｍ×５０ｍｍ ， １．７ μ ｍ ） 或柱效相当者 ； ｂ ） 　 流动相 ： 梯度洗脱条件见表 １ ； ｃ ） 　 流动相流速 ： ０．３ｍＬ ／ ｍｉｎ ； ｄ ） 　 色谱柱柱温 ： ３０℃ ； ｅ ） 　 样品室温度 ： ４℃ ； ｆ ） 　 进样体积 ： ４ μ Ｌ 。 表 １ 　 流动相梯度洗脱参考条件 时间 ｍｉｎ０．１％ 甲酸溶液 （ 体积分数 ） ％ 乙腈 （ 体积分数 ） ％ ０ ９５ ５ ０．５ ９５ ５ ３．５ ７０ ３０ ４．０ １０ ９０ ４．７ １０ ９０ ５．４ ９５ ５ ６．０ ９５ ５ ７ ． ３ ． ３ ． ２ 　 质谱参考条件 质谱参考条件如下 ： ａ ） 　 离子化模式 ： 电喷雾电离正离子扫描模式 ； ｂ ） 　 质谱扫描方式 ： 多反应