书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犌 ００ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３７８７４ — ２０１９ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犌犲狀犲狉犪犾狉狌犾犲狊犳狅狉犲狏犪犾狌犪狋犻狅狀狅犳狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犪狀犱狆狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊 ２０１９  ０８  ３０ /G2D /G2E ２０１９  ０８  ３０ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书目 　　 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… １ 　 范围 １ ……………………………………………………………………………………………………… ２ 　 规范性引用文件 １ ………………………………………………………………………………………… ３ 　 术语和定义 、 缩略语 １ ……………………………………………………………………………………… ４ 　 基本要求 ２ ………………………………………………………………………………………………… ５ 　 指标参数 ２ ………………………………………………………………………………………………… ６ 　 评价方法 ３ ………………………………………………………………………………………………… Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３７８７４ — ２０１９ 前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由国家标准物质研究中心提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国科学院北京基因组研究所 、 中国计量科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 孟庆姝 、 傅博强 、 胡松年 、 葛晓萌 、 谈昕煜 、 牛春艳 、 毕小春 。 Ⅲ 犌犅 ／ 犜 ３７８７４ — ２０１９ 核酸提取纯化方法评价通则 １ 　 范围 本标准规定了核酸提取纯化方法评价的指标参数和评价方法 。 本标准适用于分子生物学实验室对于常规样本 （ 新鲜样本 ） 的核酸 （ 基因组 ＤＮＡ 与总 ＲＮＡ ） 提取 纯化方法的一般性评价 。 本标准不适用于病毒核酸的提取 ， 游离 ＤＮＡ 的提取 ， 陈旧样本 、 微量样本与高度降解样本核酸的 提取方法的评价 ， 也不适用于在提取过程中通过添加外源 ＤＮＡ 或 ＲＮＡ 以提高提取效率的核酸提取方 法的评价 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修订单 ） 适用于本文件 。 ＩＳＯ８６５５２ ： ２００２ 　 活塞式容量测量器 　 第 ２ 部分 ： 活塞移液器 （ Ｐｉｓｔｏｎｏｐｅｒａｔｅｄｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｐｐａ ｒａｔｕｓ — Ｐａｒｔ２ ： Ｐｉｓｔｏｎｐｉｐｅｔｔｅｓ ） ３ 　 术语和定义 、 缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 核酸 　 狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱 由核苷酸或脱氧核苷酸通过 ３′ ， ５′ 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子 。 具有非常重要的生物 功能 ， 主要是贮存遗传信息和传递遗传信息 。 包括核糖核酸 （ ＲＮＡ ） 和脱氧核糖核酸 （ ＤＮＡ ） 两类 。 ［ ＪＪＦ１２６５ — ２０１０ ， 定义 ４．４２ ］ ３ ． １ ． ２ 标准物质 　 狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿犪狋犲狉犻犪犾 具有足够均匀和稳定的特定特性的物质 ， 其特性被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期 用途 。 ［ ＪＪＦ１００１ — ２０１１ ， 定义 ８．１４ ］ ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＯＤ ： 光密度 （ ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ ） １ 犌犅 ／ 犜 ３７８７４ — ２０１９ ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＴＥ ： 三羟甲基氨基甲烷  乙二胺四乙酸 （ ＴｒｉｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） Ｔｒｉｓ ： 三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ） ４ 　 基本要求 常规的用于分子生物学提取核酸的样本主要包括新鲜的动植物组织样本 、 细胞样本 、 血液样本 、 唾液样本和粪便样本等 。 宜选用新鲜样本进行核酸提取 ； 若不能马上提取 ， 应分装成小份 ， 按照样本特性 与采集情况妥善保存 。 ５ 　 指标参数 ５ ． １ 　 核酸完整度 ５ ． １ ． １ 　 一般说明 核酸完整度表征提取过程中保持核酸一级结构 （ 序列 ） 完整而不发生改变的程度 。 在核酸提取时应尽量防止物理 （ 剪切力 、 高温 ）、 化学因素 （ 强酸 、 强碱 ） 和生物因素 （ 核酸酶 ） 的破坏 。 根据试验条件和核 酸样品 ， 可以选择琼脂糖凝胶电泳方法进行核酸完整度测定 ， 根据条带位置和不同条带的荧光亮度分析 综合计算评价核酸的完整性 。 ５ ． １ ． ２ 　 犇犖犃 完整度 用琼脂糖凝胶电泳法检测 ， 完整基因组 ＤＮＡ 电泳结果为一条清晰明亮的条带 ， 条带拖尾或者弥散代表 ＤＮＡ 有部分降解 。 ５ ． １ ． ３ 　 总 犚犖犃 完整度 ５ ． １ ． ３ ． １ 　 真核生物总 犚犖犃 完整度 用琼脂糖凝胶电泳法检测 ， 真核生物完整的总 ＲＮＡ 电泳结果为清晰的两条条带 ２８Ｓ 和 １８Ｓ 核糖体 ＲＮＡ 条带 。 ２８Ｓ 和 １８Ｓ 核糖体 ＲＮＡ 条带清晰 ， 且两条条带的荧光亮度比值 （ ２８Ｓ∶１８Ｓ ） ＞ １ ， 以满足 后续试验的要求 。 ５ ． １ ． ３ ． ２ 　 原核生物总 犚犖犃 完整度 用琼脂糖凝胶电泳法检测 ， 原核生物完整的总 ＲＮＡ 电泳结果为清晰的两条条带 ２３Ｓ 和 １６Ｓ 核糖体 ＲＮＡ 条带 。 ２３Ｓ 和 １６Ｓ 核糖体 ＲＮＡ 条带清晰 ， 且两条条带的荧光亮度比值 （ ２３Ｓ∶１６Ｓ ） ＞ １ ， 该完整 度可以满足绝大部分后续试验的要求 。 ５ ． １ ． ３ ． ３ 　 总 犚犖犃 降解 用琼脂糖凝胶电泳法检测 ， 如果电泳条带弥散 ， 没有清晰的核糖体 ＲＮＡ 条带 ， 为部分降解的 ＲＮＡ 样品 ； 电泳条带呈现极低分子质量处的弥散状 ， 为完全降解的 ＲＮＡ 样品 。 ５ ． ２ 　 提取产量 提取产量是指单位样本中提取得到的核酸 （ ＤＮＡ 或 ＲＮＡ ） 的总质量 。 该指标用于表征提取得率 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３７８７４ — ２０１９ 采用微量紫外测定仪和 ／ 或微量荧光剂测定提取液中的核酸质量浓度 （ ｎｇ ／ μ Ｌ ）， 结合提取液体积计算提 取量 ， 计算得率 。 计算公式与参考得率见 ６．２．３ 。 ５ ． ３ 　 核酸纯度 ５ ． ３ ． １ 　 一般说明 核酸纯度是指核酸提取物中目标核酸的纯度 ， 该指标用于表征核酸提取物中目标核酸与残留杂质 的相对含量 ， 对于后续的分子生物学试验有重要的影响 。 核酸在特定波长的吸光度值及其在不同波长 吸光度值的比率对不同性质的核酸有对应的特征值 ， 用以表征提取液的核酸纯度 。 用紫外分光光度计 测定 ２６０ｎｍ 、 ２８０ｎｍ 、 ２３０ｎｍ 下提取液的吸光度 ＯＤ ２６０ 、 ＯＤ ２８０ 、 ＯＤ ２３０ ， 计算 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 和 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２３０ ， 表征核酸纯度 。 测量吸光度时 ， 需调整核酸浓度 ， 保证核酸吸光值 ＯＤ ２６０ 在 ０．１ ～ １．５ 之间 。 ５ ． ３ ． ２ 　 犇犖犃 纯度 纯 ＤＮＡＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 为 １．８ ， 在 ＤＮＡ 提取获得的产物中 ， ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 在 １．７ ～ １．９ 表明 ＤＮＡ 纯度 符合后续一般分子生物学试验需要 。 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ ＞ １．９ 时表明有 ＲＮＡ 污染 ； ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ ＜ １．７ 时表 明有蛋白质 、 多酚等污染 。 纯 ＤＮＡＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２３０ ＞ ２．０ 。 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２３０ ＜ ２．０ ， 表明有残存的盐或其他小 分子杂质 。 ５ ． ３ ． ３ 　 犚犖犃 纯度 纯 ＲＮＡ 的 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 为 ２．０ ， ＲＮＡ 提取溶液的 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ 在 １．７ ～ ２．０ 表明 ＲＮＡ 纯度基本可 以满足后续分子生物学试验处理需要 。 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ ＜ １．７ 时表明有蛋白质或多酚污染 ； ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２８０ ＞ ２．０ 时表明可能有异硫氰酸残存 。 纯 ＲＮＡ 的 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２３０ ＞ ２．０ 。 ＯＤ ２６０ ／ ＯＤ ２３０ ＜ ２．０ ， 表