书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ４０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３７８７０ — ２０１９ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犐狀犱犻狏犻犱狌犪犾犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犫狔犺犻犵犺狋犺狉狅狌犵犺狆狌狋狊犲狇狌犲狀犮犻狀犵犿犲狋犺狅犱 ２０１９  ０８  ３０ /G2D /G2E ２０１９  ０８  ３０ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由国家标准物质研究中心提出并归口 。 本标准起草单位 ： 深圳华大生命科学研究院 （ 原深圳华大基因研究院 ）、 中国计量科学研究院 、 深圳华大智造科技有限公司 、 深圳华大基因科技有限公司 、 深圳基因产学研资联盟 。 本标准主要起草人 ： 谢一帆 、 王晶 、 谢伟伟 、 陈芳 、 蒋慧 、 杜佳婷 、 牛春艳 、 李陶莎 、 刘心 、 程奇 、 李倩一 、 李岱怡 、 谢强 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３７８７０ — ２０１９ 引 　　 言 　　 个体鉴定在恐怖事件 、 重大灾害 、 交通事故的急救医学和侦查破案中有较大的适用性 。 本标准是结合核酸生物技术和高通量测序技术以检测人体样本的 ＳＴＲ 位点和 ＳＮＰ 位点进行个体鉴定 ， 对于维护社会稳定有极其重要的意义 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３７８７０ — ２０１９ 个体鉴定的高通量测序方法 １ 　 范围 本标准规定了个体鉴定高通量测序方法的术语和定义 、 原理 、 试验条件 、 仪器与设备 、 试剂 、 试验步骤和结果分析 。 本标准适用于人体的血液及血痕 、 毛发 、 唾液斑等样本的个体鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ２９８５９ — ２０１３ 　 生物信息学术语 ＧＢ ／ Ｔ３０９８９ — ２０１４ 　 高通量基因测序技术规程 ３ 　 术语和定义 ＧＢ ／ Ｔ２９８５９ — ２０１３ 及 ＧＢ ／ Ｔ３０９８９ — ２０１４ 界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。 为了便于使用 ， 以下重复列出了 ＧＢ ／ Ｔ２９８５９ — ２０１３ 及 ＧＢ ／ Ｔ３０９８９ — ２０１４ 中的某些术语和定义 。 ３ ． １ 　 测序 　 狊犲狇狌犲狀犮犻狀犵 测定氨基酸或核苷酸序列的过程 。 ［ ＧＢ ／ Ｔ２９８５９ — ２０１３ ， 定义 ２．４．１３ ］ ３ ． ２ 　 高通量基因测序 　 犺犻犵犺狋犺狉狅狌犵犺狆狌狋犵犲狀犲狊犲狇狌犲狀犮犻狀犵 区别于传统 Ｓａｎｇｅｒ （ 双脱氧法 ） 测序 ， 能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术 ， 通常一次测序反应能产出不低于 １００Ｍｂ 的测序数据 。 ［ ＧＢ ／ Ｔ３０９８９ — ２０１４ ， 定义 ３．１９ ］ ４ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ｄＮＴＰ ： 脱氧核糖核苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＮＰ ： 单核苷酸多态性 （ ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ） ＳＴＲ ： 短串联重复序列 （ ＳｈｏｒｔＴａｎｄｅｍＲｅｐｅａｔ ） ５ 　 原理 采集样本后 ， 结合核酸生物技术和高通量测序技术 ， 检测特异的分子遗传标记位点 （ ＳＴＲ 位点和 １ 犌犅 ／ 犜 ３７８７０ — ２０１９ ＳＮＰ 位点 ）， 通过比较测试样本与待检者的分型结果是否均相同 ， 鉴定测试样本是否来源于待检者 。 若测试样本与待检者的分子遗传标记位点分型均相同 ， 则判断为匹配 。 若测试样本与待检者有两个及以上位点分型结果不同 ， 在排除等位基因丢失等前提下 ， 判断为不匹配 。 若测试样本与待检者只有一个位点分型结果不同 ， 不能排除测试样本来源于待检者 ， 需要增加更多特异的分子遗传标记位点进行检测 。 增加检测更多位点后 ， 测试样本与待检者有两个及以上位点分型结果不同 ， 判断为不匹配 。 测试样本与待检者匹配的原因有两种 ： 一是测试样本可能来源于待检者 ； 二是测试样本可能来源于人群中的随机个体 ， 仅仅是分子遗传标记位点分型碰巧相同 。 因此 ， 需要通过计算匹配概率和似然率来进行个体鉴定 。 匹配概率是人群中的随机个体纯粹由于机会与待检者分型结果一致的概率 ， 以此估计一个理论上的随机个体碰巧匹配的可能性 。 似然率在数值上等于样本来源于待检者的概率与样本来源于随机个体的概率比值 。 ６ 　 试验条件 实验室应做到防止污染 ， 根据功能划分为试剂储存和准备区 、 样本制备区 、 扩增区 、 扩增产物分析区和其他区域 。 实验室人员应具备良好的分子生物学专业技术操作能力 。 ７ 　 仪器与设备 ７ ． １ 　 ＰＣＲ 仪 ： 温度设置范围为 ０℃ ～ ９９℃ ， 最大循环数为 ９９ 。 ７ ． ２ 　 高通量测序仪 ： 测序通量 ≥ １００Ｍｂ ， 碱基识别质量 ＞ ２０ ， 碱基识别正确率 ≥ ９９．９％ 。 ７ ． ３ 　 离心机 ： 实验室通用高速离心机 ， 最高转速不低于 １６０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ７ ． ４ 　 涡旋振荡仪 。 ７ ． ５ 　 冰箱 ： 温度调节范围为 －２０℃ ～ ４℃ 。 ８ 　 试剂 ８ ． １ 　 试验用水 一级水 ， 电导率 （ ２５℃ ） ≤ ０．０１ｍＳ ／ ｍ ， 吸光度 （ ２５４ｎｍ ， １ｃｍ 光程 ） ≤ ０．００１ ， 可溶性硅 （ 以 ＳｉＯ ２ 计 ） 含量 ≤ ０．０１ｍｇ ／ Ｌ 。 ８ ． ２ 　 犇犖犃 提取试剂 ８ ． ２ ． １ 　 犆犺犲犾犲狓 １００ 试剂 Ｃｈｅｌｅｘ１００ 、 ＴＮＥ 缓冲液 、 蛋白酶 Ｋ 、 十二烷基硫酸钠 （ ＳＤＳ ）、 二硫苏糖醇 （ ＤＴＴ ）。 注 ： Ｃｈｅｌｅｘ 为聚苯乙烯二乙烯基苯树脂 。 ８ ． ２ ． ２ 　 试剂盒 基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 。 ８ ． ３ 　 犘犆犚 扩增试剂 个体鉴定的引物混合液及 ＰＣＲ 反应的预混体系 。 ＰＣＲ 反应的预混体系包括 ＤＮＡ 聚合酶 、 ＰＣＲ ２ 犌犅 ／ 犜 ３７８７０ — ２０１９ 缓冲液 、 镁离子 、 ｄＮＴＰ 、 ＰＣＲ 稳定剂和增强剂 。 ８ ． ４ 　 建库试剂 核酸样品的基因文库构建试剂包含 ＤＮＡ 聚合酶 、 ＰＣＲ 缓冲液 。 ８ ． ５ 　 平行扩增试剂 构建好的基因文库平行扩增试剂包含扩增引物 、 高效扩增酶缓冲液 。 ８ ． ６ 　 高通量测序试剂 高通量测序试剂包含测序引物 、 高效测序反应酶 、 缓冲液 。 ９ 　 试验步骤 ９ ． １ 　 选择分子遗传标记位点 选取高多态性的 ＳＴＲ 位点和杂合度大于 ０．３ 的 ＳＮＰ 位点 ， 作为候选的分子遗传标记位点 ， 并进行引物设计与合成 （ 参见附录 Ａ ）。 当多个 ＳＮＰ 位点同时使用时 ， 或 ＳＮＰ 位点与 ＳＴＲ 位点同时使用时 ， 需有证据表明 ＳＮＰ 位点两两之间是相互独立的 ， 或 ＳＮＰ 位点与 ＳＴＲ 位点两两之间是相互独立的 。 当不能证明相互独立时按多个位点组合成的单倍型进行匹配概率和似然率的计算 。 ９ ． ２ 　 犇犖犃 提取 ９ ． ２ ． １ 　 总则 采用 Ｃｈｅｌｅｘ 法或试剂盒法进行 ＤＮＡ 提取 。 提取后的 ＤＮＡ 浓度应大于 １ｎｇ ／ μ Ｌ ， 应置于 －２０℃ 或 －２０℃ 以下条件保存 。 ９ ． ２ ． ２ 　 犆犺犲犾犲狓 法 当样本为血液和血痕 、 毛发 、 唾液斑时可采用 Ｃｈｅｌｅｘ 法 。 ａ ） 　 血液和血痕 ： 取少量血液或血痕加入适量纯水 ， 剧烈振荡 ， 室温下放置 ３０ｍｉｎ 以上 。 １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 后去上清液 ， 沉淀中加入 ２００ μ Ｌ５％Ｃｈｅｌｅｘ１００ 溶液 （ 使用前要充分振摇 ， 使 Ｃｈｅｌｅｘ１００ 颗粒悬浮 ） 和 １０ μ Ｌ５ｍｇ ／ ｍＬ 的蛋白酶 Ｋ ， 在振荡器上反复振荡 ， 放入 ５６℃ 保温 ３０ｍｉｎ 以上 。 取出后振荡 ， １００℃ 保温 ８ｍｉｎ ， １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 后 ， 上清液用于 ＰＣＲ 扩增或置 ４℃ 冰箱内低温保存备用 。 ｂ ） 　 带毛囊的毛发 ： 剪取毛根部分 ５ｍｍ ～ １０ｍｍ ， 无水乙醇 、 水 、 无水乙醇各冲洗一次 ， 晾干后加入 ３０ μ Ｌ５％Ｃｈｅｌｅｘ１００ 溶液和 ２ μ Ｌ５ｍｇ ／ ｍＬ 的蛋白酶 Ｋ ， ５６℃ 消化至完全溶解 。 取出后振荡 ， １００℃ 保温 ８ｍｉｎ ， １３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 后 ， 上清液用于 ＰＣＲ 扩增或置 ４℃ 冰箱内低温保存