书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６８４７ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犃犮犻犱狅狏狅狉犪狓犮犪狋狋犾犲狔犪犲 ２０１８  ０９  １７ /G2D /G2E ２０１９  ０４  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局 、 中华人民共和国二连浩特出入境检验检疫局 、 中华人民共和国云南出入境检验检疫局 、 中华人民共和国天津出入境检验检疫局 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 赵文军 、 王溪桥 、 张永宏 、 田茜 、 寸东义 、 廖芳 、 历艳 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８４７ — ２０１８ 兰花褐斑病菌检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了兰花褐斑病菌的分离培养 、 免疫学及分子生物学等检测鉴定方法 。 本标准适用于兰花植株中兰花褐斑病菌的检疫鉴定及该病害的田间调查与监测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ１１５７ 　 进出境植物苗木检疫规程 ３ 　 兰花褐斑病菌的基本信息 中文名 ： 兰花褐斑病菌 ， 兰花细菌性褐斑病菌学名 ： 犃犮犻犱狅狏狅狉犪狓犮犪狋狋犾犲狔犪犲 （ Ｐａｖａｒｉｎｏ１９１１ ） Ｓｃｈａａｄｅｔａｌ．２００９ 异名 ： 犃犮犻犱狅狏狅狉犪狓犪狏犲狀犪犲 ｓｕｂｓｐ． 犮犪狋狋犾犲狔犪犲 （ Ｐａｖａｒｉｎｏ１９１１ ） Ｗｉｌｌｅｍｓｅｔａｌ．１９９２ 犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊犮犪狋狋犾犲狔犪犲 （ Ｐａｖａｒｉｎｏ１９１１ ） Ｓａｖｕｌｅｓｃｕ１９４７ 犅犪犮犻犾犾狌狊犮犪狋狋犾犲狔犪犲 （ Ｐａｖａｒｉｎｏ ） Ｓｔａｐｐ１９２８ 犅犪犮狋犲狉犻狌犿犮犪狋狋犾犲狔犪犲 Ｐａｖａｒｉｎｏ１９１１ 犘犺狔狋狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犮犪狋狋犾犲狔犪犲 （ Ｐａｖａｒｉｎｏ ） Ｍａｇｒｏｕ＆Ｐｒｅｖｏｔ１９４８ 犘犺狔狋狅犿狅狀犪狊犮犪狋狋犾犲狔犪犲 （ Ｐａｖａｒｉｎｏ ） Ａｒｋ＆Ｔｈｏｍａｓ１９４６ 英文名 ： Ｂａｃｔｅｒｉａｌｂｒｏｗｎｓｐｏｔｏｆｏｒｃｈｉｄ 分类地位 ： 细菌域 Ｂａｃｔｅｒｉａ ， 变形菌门 Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ， β  变形菌纲 Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ， 伯克氏菌目 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ， 丛毛单胞菌科 Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ ， 嗜酸菌属 犃犮犻犱狅狏狅狉犪狓 。 传播途径 ： 远距离传播主要靠带菌种苗 ， 近距离传播主要借助叶面浇水 、 喷雾或施肥而将病原菌散播至健康植株上 ， 通过叶片伤口及自然孔口侵染 ， 造成二次感染 。 兰花褐斑病菌的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 原理 根据兰花褐斑病菌与抗体之间的特异性反应 ， 对植株或叶片进行免疫学检测 ； 根据兰花褐斑病菌的特异性 ＤＮＡ 序列进行分子生物学检测 ； 根据兰花褐斑病菌的培养性状 、 生物学特性 、 寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定 。 ５ 　 仪器设备及主要试剂 ５ ． １ 　 仪器设备及用具 ＰＣＲ 仪 、 实时荧光 ＰＣＲ 仪 、 显微镜 、 超净工作台 、 恒温培养箱 、 灭菌锅 、 制冰机 、 高速冷冻离心机 ， 台 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８４７ — ２０１８ 式小型离心机 、 超低温冰箱 、 常规冰箱 、 旋涡振荡器 、 微量进样器 、 电泳仪 、 凝胶成像系统 、 量筒 、 烧杯 、 培养皿 、 ＰＣＲ 管 、 离心管 、 接种环 、 玻璃棒 、 剪刀等 。 ５ ． ２ 　 主要试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 。 分子生物学检测所需试剂见附录 Ｂ 和附录 Ｃ 。 金氏 Ｂ 培养基配制方法 ： 多聚蛋白胨 ２０ｇ ， 甘油 １０ｇ ， 七水硫酸镁 １．５ｇ ， 琼脂 １５ｇ ， 加双蒸水至 １０００ｍＬ ， 调节 ｐＨ 至 ７．２ ， 湿热灭菌 （ １２１℃ ， １５ｍｉｎ ）。 ６ 　 田间观察检测 ６ ． １ 　 症状观察 对于植株样品 ， 按照 ＳＮ ／ Ｔ１１５７ 要求 ， 参照附录 Ａ 中的症状描述观察是否有兰花褐斑病的典型症状 ， 对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录 ， 并采集表现症状植株送实验室进行检测鉴定 ， 田间无症状植株可随机采样 。 ６ ． ２ 　 现场检测 利用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测 ， 按照操作说明进行检测及结果判定 。 ７ 　 实验室检测 ７ ． １ 　 样品制备 对于有症状的样品 ， 低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象 ， 若有溢菌现象 ， 用灭菌剪刀剪取新鲜病叶上的病健交界处 （ 对于无症状样品 ， 随机选取植物组织 ）， 在 ７５％ 乙醇或含有效氯 １％ 的次氯酸钠溶液中表面消毒 ５０ｓ ～ ６０ｓ ， 无菌水清洗 ３ 次 ， 然后将其移至灭菌培养皿中 ， 加适量无菌水 ， 用灭菌镊子或剪刀将病组织捣碎 ， 静置 ５ｍｉｎ ～ １０ｍｉｎ ， 即制成组织悬浮液 ， 用于分离培养 、 免疫学检测及分子生物学检测 。 ７ ． ２ 　 免疫学检测 利用商品化的 ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒进行检测 ， 按照说明进行操作及结果判定 。 ７ ． ３ 　 分子生物学检测 ７ ． ３ ． １ 　 模板制备 按照 ７．１ 的方法制备成样品悬浮液后 ， 直接用商业化植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒按照操作说明提取样品总 ＤＮＡ ， －２０℃ 保存备用 。 对于分离培养得到的疑似菌株 ， 可直接或经裂解处理后 （ ９７℃ 沸水浴 １０ｍｉｎ ； １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液 ， －２０℃ 保存 ） 作为分子生物学检测反应模板 。 根据实验室条件 ， 可选择下列任一方法 （ ７．３．２ 或 ７．３．３ ） 进行检测 。 ７ ． ３ ． ２ 　 犘犆犚 凝胶电泳检测 对于叶片等植株样品 ， 以已知带菌的兰花植株组织作阳性对照 （ 若无已知带菌材料 ， 可用模拟带菌方式代替 ）， 以健康的兰花植株组织作阴性对照 ， 以双蒸水代替模板作为空白对照 ， 对待测样品进行 ＰＣＲ 凝胶电泳检测 。 对于纯培养菌株 ， 以 犃 ． 犮犪狋狋犾犲狔犪犲 标准菌株作阳性对照 ， 用非 犃 ． 犮犪狋狋犾犲狔犪犲 的植物细菌作阴性 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８４７ — ２０１８ 对照 ， 以双蒸水代替模板作为空白对照 ， 对待测样品进行 ＰＣＲ 凝胶电泳检测 ， 具体检测步骤见附录 Ｂ 。 ７ ． ３ ． ３ 　 实时荧光 犘犆犚 检测 实时荧光 ＰＣＲ 检测具体步骤见附录 Ｃ ， 对照设置同 ７．３．２ 。 ７ ． ４ 　 分离培养鉴定 按照 ７．１ 的方法制备成组织悬浮液后 ， 用灭菌接种环蘸取悬浮液在金氏 Ｂ 培养基平板上划线分离 ， 重复 ３ 次 ， ２８℃ 恒温培养 ４８ｈ ， 挑取可疑单菌落进行纯化 ， 转接 ２ 次 ～ ３ 次 ， 随后进行致病性测定 、 Ｂｉｏｌｏｇ 鉴定 、 免疫学或分子生物学鉴定 。 ７ ． ５ 　 犅犻狅犾狅犵 鉴定 利用 Ｂｉｏｌｏｇ 微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定 ， 按照说明书进行操作及结果判定 。 ７ ． ６ 　 致病性测定 如果有争议或者有必要需按以下步骤对分离纯化的菌株进行致病性测定 。 将待测菌株在金氏 Ｂ 培养基上培养 ４８ｈ 左右 ， 用无菌水配成 １０ ８ ＣＦＵ ／ ｍＬ 左右的细菌悬浮液 ， 用针刺法接种至兰花叶片上 ， ２８℃ 保湿培养 ， 观察是否出现附录 Ａ 所描述的症状 。 ８ 　 结果评定 依据表 １ 进行检测结果判定 。 表 １ 免疫学或分子 生物学检测分离培养鉴定 致病性测定 Ｂｉｏｌｏｇ 鉴定 （ 可选 ） 结果判定 任一方法阳性 阳性 阳性 阳性 样品检出兰花褐斑病菌 任一方法阳性 阴性 — — 样品未检出兰花褐斑病菌 任一方法阴性 — — — 样品未检出兰花褐斑病菌 ９ 　 样品及资料保存 ９ ． １ 　 样品及菌种保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存 。 对检出兰花褐斑病菌的样品应保存于 ４℃ 冰箱中 ， 以备复核 。 该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 。 从检测样品中分离并鉴定为兰花褐斑病菌的菌株 ， 应妥善保存 。 可采用甘油保存或冻干保存 。 对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理 。 ９ ． ２ 　 结果记录与资料保存 完整的实验记录应包括 ： 样品来源 、 种类 、 时间 ， 检测时间 、 地