书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６８４３ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊 犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪狆狔狉犻 ２０１８  ０９  １７ /G2D /G2E ２０１９  ０４  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、 中华人民共和国福建出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 王有福 、 李鑫 、 于文涛 、 刘冉 、 冯茜茜 、 于爽 、 王秀芬 、 张寅寅 、 黑多尔 、 刘卉秋 、 胡强 、 曹冬梅 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８４３ — ２０１８ 梨衰退植原体检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了梨衰退植原体 犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊 Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａｐｙｒｉ 的检疫和鉴定方法 。 本标准适用于蔷薇科及夹竹桃科等植株及其繁殖材料和传播介体中梨衰退植原体的检疫和鉴定 。 ２ 　 梨衰退植原体基本信息 中文名 ： 梨衰退植原体学名 ： 犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊 ＰｈｙｔｏｐｌａｓｍａｐｙｒｉＳｅｅｍüｌｌｅｒ＆Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ 英文名 ： ｐｅａｒｄｅｃｌｉｎｅ ； Ｐａｒｒｙｓｄｉｓｅａｓｅ ； ｐｅａｃｈｙｅｌｌｏｗｌｅａｆｒｏｌｌ ； ｐｅａｒｌｅａｆｃｕｒｌ ； ｐｅａｒｍｏｒｉａ 分类地位 ： 细菌界 （ Ｂａｃｔｅｒｉａ ）， 硬壁菌门 （ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ）， 柔膜菌纲 （ Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ ）， 非固醇菌原体目 （ Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ ）， 非固醇菌原体科 （ Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ ）， 植原体属 （ 犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪 ）， １６Ｓｒ Ⅹ Ｃ 植原体组 。 其他信息参见附录 Ａ 。 ３ 　 方法原理 梨衰退植原体症状和基因特性作为本标准鉴定方法的依据 。 ４ 　 仪器设备和主要试剂 ４ ． １ 　 仪器设备 定性 ＰＣＲ 仪 、 定量 ＰＣＲ 仪 、 超净工作台 、 高压灭菌锅 、 高速冷冻离心机 、 台式冷冻离心机 、 纯水仪 、 台式小型离心机 、 冰箱 、 旋涡震荡器 、 微量进样器 、 电泳仪 、 水浴锅 、 凝胶成像系统等 。 ４ ． ２ 　 主要试剂 除非另有说明 ， 在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水 。 ＰＣＲ 反应体系用双蒸水 。 ＤＮＡ 提取试剂可参照附录 Ｂ 准备 ， 其他试剂 ， 比如各种溶液 、 缓冲液和培养基等检测方法特有的 ， 按附录 Ｃ 、 附录 Ｄ 和附录 Ｅ 要求准备 。 商品化试剂参见其使用说明 。 植物 ＤＮＡ 提取试剂盒 、 ＰＣＲ 预混液 （ ＰＣＲＰｒｅｍｉｘ ）、 超纯水 、 ＤＮＡ 分子量标记 （ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ ） 及 ＤＮＡ 提取试剂等 。 核酸提取研磨液 （ １００ｍＬ ）： 三水合磷酸氢二钾 （ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ · ３Ｈ ２ Ｏ ）， ２．１７ｇ ； 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ）， ０．４１ｇ ； 蔗糖 ， １０ｇ ； 牛血清白蛋白 （ ＢＳＡ ）， ０．１５ｇ ； 聚乙烯吡咯烷酮 （ ＰＶＰ１０ ）， ２ｇ 。 ｐＨ７．６ 高温灭菌 ， ４℃ 保存 。 ＤＮＡ 提取液 ： ＴｒｉｓＨＣｌ ， １００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ； ＥＤＴＡ ， １００ｍｍｏｌ ／ Ｌ ； ＮａＣｌ ， ２５０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ； 调 ｐＨ 至 ８．０ 。 ５０×ＴＡＥ ： ２．０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓ ， １．０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 醋酸钠 ， ５０ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， ｐＨ８．０ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８４３ — ２０１８ ５ 　 检测方法 ５ ． １ 　 症状观察 现场对梨树的种苗 、 枝条 （ 带叶片 ） 仔细观察 ： 该病害可引起新梢生长不良 ， 叶小 ， 叶缘向上卷缩 ， 叶 量减少 ， 叶脉变褐叶片变灰 ， 呈革质 。 受侵染后的植株在第一年秋天可见叶片变红且提前脱落症状 ， 第二年春天呈现叶子变小 ， 且颜色苍白 ， 芽小或不长芽 ， 不结果实 。 梨树的种苗 、 枝条 （ 不带叶片 ）： 感染植株树势衰弱 ， 终端生长减少或停止 ， 严重时可引起整株萎缩或死亡 。 其最典型症状是在嫁接处 ， 可见褐色线 。 其余症状参见附录 Ａ 。 选取可疑症状植株样品和随机样品带回实验室检测 。 ５ ． ２ 　 分子生物学检测 ５ ． ２ ． １ 　 样品 犇犖犃 提取 将采集的样品进行 ＤＮＡ 提取 （ 最好是疑似样品的叶脉部分 ）， 具体操作参见附录 Ｂ 。 ５ ． ２ ． ２ 　 植原体巢氏 犘犆犚 扩增及检测 采用植原体通用引物对 Ｐ１ ／ Ｐ７ 及梨衰退植原体特异性引物 ｆＰＤ ／ ｒＰＤｓ 对进行巢式 ＰＣＲ 反应及凝 胶电泳检测 ， 具体操作步骤见附录 Ｃ 。 ５ ． ２ ． ３ 　 序列比对及发育树分析 将上述序列进行测序后 ， 在 Ｇｅｎｂａｎｋ 中进行比对 ， 建立系统发育树进行亲缘关系分析 。 ５ ． ２ ． ４ 　 电子酶切图谱 （ 犚犉犔犘 ） 分析 采用植原体通用引物对 Ｐ１ ／ Ｐ７ 及 Ｒ１６Ｆ２ ／ Ｒ１６Ｒ２ 对进行巢式 ＰＣＲ 反应 ， 将获得片段进行测序后 ， 应用软件进行分析 。 具体步骤及分析图谱见附录 Ｄ 。 ５ ． ２ ． ５ 　 植原体实时荧光 犘犆犚 检测 针对梨衰退植原体 １６ＳｒＤＮＡ 的基因特性 ， 采用梨衰退植原体的 Ｃｙｃｌｅａｖｅ 实时荧光特异性引物和 探针 （ ＬＳＴＰｒｉｍｅｒＦ ／ ＬＳＴＰｒｉｍｅｒＲ ； ＬＳＴＰｒｏｂｅ ） 进行扩增检测 ， 具体操作方法见附录 Ｅ 。 ６ 　 结果判定 ６ ． １ 　 巢氏 犘犆犚 检测 样品表现 ５．１ 所述症状 ， 且 ５．２．２ 检测实验中空白 、 阴性对照无条带 ， 阳性反应有条带 ， 样品无条带 下 ， 检测结果阴性 ； 样品表现 ５．１ 所述症状 ， 且 ５．２．２ 检测实验中空白 、 阴性对照无条带 ， 阳性反应有条带 ， 样品有条带 ， 则判断样品携带梨衰退植原体病原 。 ６ ． ２ 　 电子酶切图谱 （ 犚犉犔犘 ） 分析 经电子酶切图谱分析后 ， 与附录 Ｄ 中图谱一致可判定该样品携带梨衰退植原体 ； 若与电子图谱不 一致 ， 则判断为不携带梨衰退植原体 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８４３ — ２０１８ ６ ． ３ 　 犆狔犮犾犲犪狏犲 实时荧光 犘犆犚 检测 样品表现 ５．１ 所述症状 ， 且 ５．２．４ 检测实验中空白 、 阴性对照无反应 ， 阳性有反应 ， 样品无反应 ， 检测结果阴性 ； 样品表现 ５．１ 所述症状 ， 且 ５．２．４ 检测实验空白 、 阴性对照无反应 ， 阳性有反应 ， 样品有反应 ， 则判断样品携带梨衰退植原体病原 。 此外 ， 样品表现 ５．１ 所述症状 ， 经一种方法检测无阳性反应 ， 建议采取另一种方法再次进行验证 ， 均为阴性时 ， 则判断样品不携带梨衰退植原体病原 。 若为随机样本 ， 不显症状植株 ， 选取其中一种检测方法检测 ， 阳性结果需用另一方法再次确认 ； 阴性结果判定样品不携带梨衰退植原体病原 。 ７ 　 样品保存与结果记录 ７ ． １ 　 样品保存 经检测确定检出梨衰退植原体的样品应保存于 －２０℃ 或 －８０℃ 冰箱中 ， 至少半年 。 ７ ． ２ 　 结果记录 完整的实验记录包括 ： 样品的来源 、 种类 、 时间 ， 实验的时间 、 地点 、 方法和结果等 ， 并要有实验人员和审核人员签字 。 ＰＣＲ 凝胶电泳检测应有电泳结果照片 ， 实时荧光 ＰＣＲ 检测应有扩增结果图片 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３６８４３ — ２０１８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 梨衰退植原体相关资料 犃 ． １ 　 典型症状 症状分急性和慢性两种类型 ： 慢性型表现为病株逐渐衰弱 ， 数年内仍能生存而不枯死 。 急性型表现为病株发病几周内树势严重衰弱 ， 很快凋萎枯死 。 症状类型与砧木种类及抗性密切相关 ， 用雪梨 、 秋子梨作砧木 ， 对植原体感病性最高 ， 易形成急性衰退症状 。 用西洋梨 、 杜梨和豆梨作砧木 ， 对衰退病有较高的抗性 ， 感病时常表现慢性衰退症状 。 梨树感染梨衰退植原体症状如图 Ａ．１ 和图 Ａ．２ 所示 。 犃 ． ２ 　 寄主范围 梨衰退植原体可侵染夹竹桃科 （ Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ ） 的长春花 （ 犆犪狋犺犪狉犪狀狋犺狌狊狉狅狊犲狌狊 ）， 桦木科 （ Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ ） 的欧洲榛 （ 犆狅狉狔犾狌狊犪狏犲犾犾犪狀犪 ）， 蔷薇科 （ Ｒｏｓａｃｅａｅ ） 的 （ 犆狔犱狅狀犻犪狅犫犾狅狀犵犪 ）、 苹果 （ 犕犪犾狌狊犱狅犿犲狊狋犻犮犪 ）、 梨 （ 犘狉狌狀狌狊狆犲狉狊犻犮犪 ）、 日本李 （ 犘狉狌狀狌狊