书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６８４１ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犘犲犪犮犺狉狅狊犲狋狋犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 ２０１８  ０９  １７ /G2E /G2F ２０１９  ０４  ０１ /G30 /G31 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2E /G2F书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国南海出入境检验检疫局 、 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、 中华人民共和国烟台出入境检验检疫局 、 浙江大学 。 本标准主要起草人 ： 张永江 、 邱艳红 、 谈 臖 、 廖富荣 、 向均 、 李金庆 、 吴建祥 、 辛言言 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８４１ — ２０１８ 桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了桃丛簇花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法 。 本标准适用于桃树 、 葡萄 、 李 、 洋李等植物材料及传播介体如线虫中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 基本信息 中文名 ： 桃丛簇花叶病毒 学名 ： 犘犲犪犮犺狉狅狊犲狋狋犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 缩写 ： ＰＲＭＶ 分类地位 ： 伴生豇豆病毒科 （ Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ ） 豇豆花叶病毒亚科 （ Ｃｏｍｏｖｉｒｉｎａｅ ） 线虫传多面体病毒属 （ 犖犲狆狅狏犻狉狌狊 ）。 桃丛簇花叶病毒的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 桃丛簇花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 ， 生物学测定为辅助鉴定手 段 。 根据 ＰＲＭＶ 与抗体之间的特异性反应 ， 对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ ＤＡＳＥＬＩＳＡ ） 和斑点酶联免疫吸附测定 （ ＤｏｔＥＬＩＳＡ ）； 依据 ＰＲＭＶ 的基因组特征进行逆转录聚合酶链式反应 （ ＲＴＰＣＲ ） 检测 。 ５ 　 仪器用具与试剂 ５ ． １ 　 仪器 电子天平 （ 感量 ０．００１ｇ ）、 高速冷冻离心机 、 小型瞬时离心机 、 普通冰箱 、 超低温冰箱 （ －８０℃ ）、 制冰 机 、 旋涡振荡器 、 磁力搅拌器 、 高压灭菌锅 、 ｐＨ 计 、 超净工作台 、 ＰＣＲ 仪 、 微波炉 、 电泳仪 、 电泳槽 、 凝胶成像分析仪 、 酶标仪 、 洗板机 、 恒温水浴锅 。 ５ ． ２ 　 用具 酶联板 、 可调移液器 （ ２．５ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ） 和可调移液器头 、 离心管 （ １．５ｍＬ 、 ２．０ｍＬ ）、 研钵 、 微型磨杵等 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８４１ — ２０１８ ５ ． ３ 　 试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中相关规定 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测试剂见附录 Ｂ ； ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｃ 。 ６ 　 检测样品的制备 ６ ． １ 　 种子 种子播于灭菌土中 ， 待长出幼苗后将表现症状的植株编号 ， 未表现症状的植株分组 （ ５ 株为 １ 组 ） 并编号 ， 采集的叶片分成 ２ 份 ， 根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测 。 ６ ． ２ 　 苗木 有症状 （ 如枝条变短丛簇 、 枝的节间缩短等 ） 的苗木编号单独检测 。 没有症状的分组并编号检测 ， 分组方法和检测方法同 ６．１ 。 ６ ． ３ 　 植物产品 植物产品有症状的部分 （ 如叶片畸形 、 花叶 、 斑驳等 ） 单独编号检测 。 没有症状或无法观察症状的植物产品 ， 应按比例取样 ， 分组编号 ， 分组方法和检测方法同 ６．１ 。 ７ 　 检测鉴定 ７ ． １ 　 犇犃犛犈犔犐犛犃 检测 把制备的样品上清液加入已包被 ＰＲＭＶ 抗体的酶联板中 ， 进行 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测 。 每个样品平行加到两个孔中 。 健康的植物组织作为阴性对照 ， 感染 ＰＲＭＶ 的植物组织作为阳性对照 ， 样品提取缓冲液作为空白对照 ； 其中阴性对照的植物种类和材料 （ 如叶片 ） 应尽量与检测样品相一致 。 具体操作见附录 Ｂ 。 ７ ． ２ 　 犚犜犘犆犚 检测 ＲＴＰＣＲ 检测的阴性和阳性对照设置同 ７．１ ， 灭菌双蒸水作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｃ 。 ７ ． ３ 　 生物学测定 将待测样品及阴性对照和阳性对照接种到鉴别寄主植物上 ， 观察症状 ， 具体操作见附录 Ｄ 。 ７ ． ４ 　 犇狅狋犈犔犐犛犃 检测 把制备的样品上清液点在硝酸纤维素膜上 ， 进行 ＤｏｔＥＬＩＳＡ 检测 ， 对照设置同 ７．１ 。 具体操作见附录 Ｅ 。 ８ 　 结果判定 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 、 ＤｏｔＥＬＩＳＡ 、 ＲＴＰＣＲ 和生物学测定中的两种检测方法结果为阳性即可判定样品携带 ＰＲＭＶ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８４１ — ２０１８ ９ 　 样品保存与结果记录 ９ ． １ 　 样品保存 经检测确定携带 ＰＲＭＶ 的样品应保存在适合的条件下以备复核 。 如种子保存在干燥室温环境中 ； 种苗 、 叶片等样品保存在 －８０℃ 冰箱中 ； 做好登记和标记工作 ， 保存期限至少 １ 年 。 ９ ． ２ 　 结果记录 记录包括样品来源 、 种类 、 检测时间 、 地点 、 方法和结果 、 检测人员签字 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测应有酶联反应数值 ； ＤｏｔＥＬＩＳＡ 检测应有检测图谱 ； ＲＴＰＣＲ 检测应有电泳图片和测序结果 ； 生物学测定应有鉴别寄主的症状照片 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３６８４１ — ２０１８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 桃丛簇花叶病毒相关资料 犃 ． １ 　 寄主范围 自然寄主包括葡萄 （ 犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪 ）、 桃 （ 犘狉狌狀狌狊狆犲狉狊犻犮犪 ）、 李 （ 犘狉狌狀狌狊狊犪犾犻犮犻狀犪 ）、 洋李 （ 犘狉狌狀狌狊犱狅犿犲狊狋犻犮犪 ）、 皱叶酸模 （ 犚狌犿犲狓犮狉犻狊狆狌狊 ）、 药用蒲公英 （ 犜犪狉犪狓犪犮狌犿狅犳犳犻犮犻狀犪犾犲 ） 等 。 鉴别寄主包括苋色藜 （ 犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犪犿犪狉犪狀狋犻犮狅犾狅狉 ）、 昆诺阿藜 （ 犆 ． 狇狌犻狀狅犪 ）、 普通烟 （ 犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿 ） 等 。 犃 ． ２ 　 危害症状 侵染桃树导致芽分化推迟 ， 春天长出的叶子斑驳 、 变窄 ， 有的畸形 ； 枝条变短 、 丛簇 ； 植株矮缩 ； 不结果或果实减少 。 侵染葡萄导致叶片不对称和斑驳 ， 枝条节间缩短 ； 浆果脱落 ； 蔓萎缩 ， 最后死亡 。 犃 ． ３ 　 分布地区 印度 、 土耳其 、 意大利 、 埃及 、 加拿大和美国 。 犃 ． ４ 　 传播方式 传毒介体 ： 美洲剑线虫 （ 犡犻狆犺犻狀犲犿犪犪犿犲狉犻犮犪狀狌犿 ）、 折环长针线虫 （ 犔狅狀犵犻犱狅狉狌狊犱犻犪犱犲犮狋狌狉狌狊 ）、 轮线虫 （ 犆狉犻犮狅狀犲犿狅犻犱犲狊 ｓｐｐ． ）。 种苗 ： 葡萄 、 桃 、 李等的无性繁殖材料如砧木 、 接穗等可传播 ； 葡萄种子 、 昆诺藜种子及药用蒲公英种子的种传率分别为 ９．５％ 、 ９０％ 和 ３．６％ 。 也可以通过机械接种 、 嫁接传播 。 犃 ． ５ 　 粒体形态 粒体为等轴对称球状正二十面体 ， 直径约为 ２４ｎｍ ～ ３０ｎｍ 。 犃 ． ６ 　 基因组 基因组为二分体基因组 ， 核酸为正单链 ＲＮＡ ， 包括 ＲＮＡ１ 和 ＲＮＡ２ 两条链 ， 分别为 ７ｋｂ 和 ６．２ｋｂ 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ３６８４１ — ２０１８ 附 　 录 　 犅 （ 规范性附录 ） 犇犃犛犈犔犐犛犃 检测 犅 ． １ 　 试剂 犅 ． １ ． １ 　 包被抗体 特异性的桃丛簇花叶病毒抗体 。 犅 ． １ ． ２ 　 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的桃丛簇花叶病毒抗体 。 犅 ． １ ． ３ 　 底物 对硝基苯磷酸二钠 （ ｐＮＰＰ ）。 犅 ． １ ． ４ 　 １× 犘犅犛犜 缓冲液 （ 狆犎 ７ ． ４ ） 氯化钠 （ ＮａＣｌ ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ８．０ｇ 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ） ０．２ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ） １．１５ｇ 氯化钾 （ ＫＣｌ ） ０．２ｇ 吐温 ２０ （ Ｔｗｅｅｎ２０ ） ０．５ｍＬ 溶于 ９００ｍＬ 双蒸水中 ， 并定容至 １