书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６８３３ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 犡 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犡 ２０１８  ０９  １７ /G2C /G2D ２０１９  ０４  ０１ /G2E /G2F /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2C /G2D书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局 、 中华人民共和国中山出入境检验检疫局 、 中国检验检疫科学研究院 、 浙江大学 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 刘洪义 、 刘忠梅 、 车瑞丰 、 陈定虎 、 魏梅生 、 张星哲 、 李桂芬 、 张永江 、 吴建祥 、 封立平 、 袁建江 、 杨立群 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８３３ — ２０１８ 马铃薯 犡 病毒检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了马铃薯 Ｘ 病毒的检疫鉴定方法 。 本标准适用于可能带有马铃薯 Ｘ 病毒的马铃薯植株 、 繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ７３３１ 　 马铃薯种薯产地检疫规程 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 　 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 ３ 　 马铃薯 犡 病毒基本信息 中文名 ： 马铃薯 Ｘ 病毒学名 ： 犘狅狋犪狋狅狏犻狉狌狊犡 缩写 ： ＰＶＸ 分类地位 ： 甲型线状病毒科 （ 犃犾狆犺犪犳犾犲狓犻狏犻狉犻犱犪犲 ）， 马铃薯 Ｘ 病毒属 （ 犘狅狋犲狓狏犻狉狌狊 ）。 传播途径 ： 田间自然条件下主要靠寄主植株不同部位 、 寄主植株之间接触摩擦进行机械传播 ， 在农事或园艺操作中 ， 还可以借助有关工具器械进行传播 。 远距离传播通过种薯等无性繁殖材料的调运完成 。 有资料表明马铃薯实生种子可传带该病毒 ， 但在生产上意义不大 ； 未见其他茄科作物种子传带该病毒的资料 。 据报道 ， 某些昆虫如异黑蝗 （ 犕犲犾犪狀狅狆犾狌狊犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪犾犻狊 ） 和绿丛螽斯 （ 犜犲狋狋犻犵狅狀犻犪狏犻狉犻犱犻狊狊犻犿犪 ） 的咀嚼式口器经机械作用可传播该病毒 ， 菟丝子 （ 犆狌狊犮狌狋犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊 ） 和集合油壶菌 （ 犛狔狀犮犺狔狉狋犻狌犿犲狀犱狅犫犻狅狋犻犮狌犿 ） 也能传播该病毒 。 马铃薯 Ｘ 病毒的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 ＰＶＸ 的基因组特征和免疫原性是该病毒检疫鉴定的依据 。 依据 ＰＶＸ 的基因组特征建立反转录 ＰＣＲ （ ＲＴＰＣＲ ）、 实时荧光反转录 ＰＣＲ （ ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ ） 和反转录环介导等温扩增 （ ＲＴＬＡＭＰ ） 检测方法 ； 依据 ＰＶＸ 免疫原性建立酶联免疫吸附测定 （ ＥＬＩＳＡ ） 方法 、 免疫层析试纸条检测方法和斑点酶联免疫吸附测定 （ ｄｏｔＥＬＩＳＡ ） 方法 ； 通过这些方法的有效组合 ， 判断样品是否带有 ＰＶＸ 。 ５ 　 仪器设备 、 用具及试剂 ５ ． １ 　 仪器设备 酶标仪 、 ＰＣＲ 仪 、 实时荧光 ＰＣＲ 仪 、 电泳系统 、 生物安全柜 、 小型离心机 、 台式冷冻离心机 、 水浴锅 、 ｐＨ 计 、 凝胶成像系统 、 制冰机 、 超低温冰箱 、 常规冰箱 、 电子天平 （ ０．００１ｇ ）、 涡旋振荡器 、 组织捣碎机 、 超 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８３３ — ２０１８ 净工作台 、 低温冰箱 、 高压灭菌锅 、 制冰机 、 微波炉 、 恒温培养箱 、 紫外分光光度计等 。 ５ ． ２ 　 用具 可调移液器 （ ２．５ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）、 吸头 、 离心管和研钵等 。 ５ ． ３ 　 试剂 除有特殊说明外 ， 所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 。 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ ＤＡＳＥＬＩＳＡ ） 所需试剂见附录 Ｂ ， ＲＴＰＣＲ 检测所需试剂见附录 Ｃ ， ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ 检测所需试剂见附录 Ｄ ， ＲＴＬＡＭＰ 检测所需试剂见附录 Ｅ ， 免疫层析试纸条检测所需试剂见附录 Ｆ ， ｄｏｔＥＬＩＳＡ 检测所需试剂见附录 Ｇ 。 ６ 　 样品的抽取及制备 ６ ． １ 　 抽样 马铃薯贸易商品或科研用薯材料或国际间种质交流材料等现场抽样按照 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 的规定执行 ， 田间调查采样按照 ＧＢ７３３１ 的规定执行 。 ６ ． ２ 　 马铃薯组培苗 、 微型薯 、 块茎等样品的制备 将马铃薯组培苗 、 微型薯 、 块茎播于非土介质或灭菌土中 ， 于 ２５℃ 左右生长并进行症状观察 。 待长出 ３ 片 ～ ４ 片真叶后将表现症状的植株单独编号 ， 未表现症状的植株分组 （ １０ 株为 １ 组 ） 并编号 。 表现可疑症状的繁殖材料 ， 可直接用于检测 ， 必要时再进行栽培生长实验 。 ６ ． ３ 　 茄科等寄主植物种子样品的制备 将种子 （ 重点挑取畸形 、 不成熟的种子 ） 播于灭菌土中 ， 于 ２５℃ 左右生长并进行症状观察 。 待长出 ３ 片 ～ ４ 片真叶后将表现症状的植株单独编号 ， 未表现症状的植株分组 （ １０ 株为 １ 组 ） 并编号 。 ７ 　 检疫鉴定方法 ７ ． １ 　 犇犃犛犈犔犐犛犃 检测 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测见附录 Ｂ 。 如选用合格的试剂盒 ， 按试剂盒说明操作 。 ７ ． ２ 　 犚犜犘犆犚 检测 ＲＴＰＣＲ 检测见附录 Ｃ 。 ７ ． ３ 　 犚犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚 检测 ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ 检测见附录 Ｄ 。 ７ ． ４ 　 犚犜犔犃犕犘 检测 ＲＴＬＡＭＰ 检测见附录 Ｅ 。 ７ ． ５ 　 免疫层析试纸条检测 免疫层析试纸条检测见附录 Ｆ 。 如选用不同生产商的合格产品 ， 按其操作说明操作 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８３３ — ２０１８ ７ ． ６ 　 犱狅狋犈犔犐犛犃 检测 ｄｏｔＥＬＩＳＡ 检测见附录 Ｇ 。 ８ 　 结果判定 ８ ． １ 　 无可疑症状的样品 ， 经 ＰＶＸ 特异性的血清学检测 （ ７．１ 、 ７．５ 、 ７．６ 任选一种 ） 或分子检测 （ ７．２ 、 ７．３ 、 ７．４ 任选一种 ） 后 ， 任意一项结果为阴性时 ， 则判定样品不带有 ＰＶＸ ； 有可疑症状的样品 ， 经 ＰＶＸ 特异性的血清学检测 （ ７．１ 、 ７．５ 、 ７．６ 任选一种 ） 和分子检测 （ ７．２ 、 ７．３ 、 ７．４ 任选一种 ） 后 ， 两项结果均为阴性时则判定样品不带有 ＰＶＸ 。 ８ ． ２ 　 ＰＶＸ 特异性的血清学检测结果 （ ７．１ 、 ７．５ 、 ７．６ 任选一种 ）、 分子检测结果 （ ７．２ 、 ７．３ 、 ７．４ 任选一种 ） 中任意两项为阳性时 ， 则判定样品带有 ＰＶＸ 。 ９ 　 样品保存与结果记录 ９ ． １ 　 样品保存 样品直接放于 －８０℃ 冰箱或冷冻干燥后放于 －２０℃ 或 －８０℃ 冰箱保存 １ 年 ， 保存的样品要做好标记和登记工作 。 以备复验 、 谈判和仲裁 。 保存期满后 ， 应经灭活处理 。 ９ ． ２ 　 结果记录 完整的实验记录要包括 ： 样品的来源 、 种类 、 时间 、 实验检测时间 、 地点 、 方法和结果 ， 并有实验人员的签字 ； 酶联免疫吸附方法应有酶联反应的原始数据 ， ｄｏｔＥＬＩＳＡ 检测应有显色图片 ， 免疫层析试纸条检测应有结果图片 ， ＲＴＰＣＲ 检测应有电泳结果图片 ， ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ 检测应有扩增曲线结果图片 ， ＲＴＬＡＭＰ 检测应有结果图片 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３６８３３ — ２０１８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 马铃薯 犡 病毒背景资料 犃 ． １ 　 寄主范围 该病毒可侵染 １６ 科 ２４０ 种植物 ， 茄科植物是其主要寄主 ， 主要危害马铃薯 （ 犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ｓｓｐ ． 狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ）、 烟草 （ 犖犻犮狅狋犻犪狀犪 ｓｐｐ ． ）、 番茄 （ 犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿 ） 等 。 其诊断寄主有白肋烟 （ 犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿 ｃｖ．Ｗｈｉｔｅｂｕｒｅｌｙ ） 及其他烟草品种 。 初侵染的叶片通常表现为坏死斑 ， 之后发展为坏死斑驳 、 褪绿 、 花叶或脉褪绿 。 在曼陀罗 （ 犇犪狋狌狉犪狊狋狉犪犿狅狀犻狌犿 ） 上继斑驳之后产生褪绿环 、 脉褪绿或脉坏死 。 烟草栽培品种适于作繁殖寄主 。 千日红 （ 犌狅犿狆犺狉犲