书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６８２１ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犆犪犾狅狀犲犮狋狉犻犪犻犾犻犮犻犮狅犾犪 犅狅犲犱犻犼狀牔犚犲犻狋狊犿犪 ２０１８  ０９  １７ /G2D /G2E ２０１９  ０４  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国烟台出入境检验检疫局 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 、 中华人民共和国威海出入境检验检疫局 、 中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 李金庆 、 张京宣 、 鲁闽 、 粟智平 、 王颖 、 段效辉 、 李春喜 、 王简 、 张卫东 、 吕文诚 、 刘鹏 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８２１ — ２０１８ 花生黑腐病菌检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了花生黑腐病菌 （ 犆犪犾狅狀犲犮狋狉犻犪犻犾犻犮犻犮狅犾犪 Ｂｏｅｄｉｊｎ＆Ｒｅｉｔｓｍａ ） 的检疫鉴定方法 。 本标准适用于花生 、 大豆等寄主植物及植物产品 、 土壤等传带的花生黑腐病菌的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ — ２０１５ 　 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 ３ 　 花生黑腐病菌基本信息及分类地位 病害英文名 ： Ｂｌａｃｋｒｏｔｏｆｐｅａｎｕｔ ， Ｒｅｄｃｒｏｗｎｒｏｔｏｆｓｏｙｂｅａｎ 有性阶段学名 ： 犆犪犾狅狀犲犮狋狉犻犪犻犾犻犮犻犮狅犾犪 Ｂｏｅｄｉｊｎ＆Ｒｅｉｔｓｍａ ， 异名 ： 犆犪犾狅狀犲犮狋狉犻犪犮狉狅狋犪犾犪狉犻犪犲 （ Ｌｏｏｓ ） Ｂｅｌｌ＆Ｓｏｂｅｒｓ 犆犪犾狅狀犲犮狋狉犻犪犻犾犻犮犻犮狅犾犪 隶属于子囊菌门 （ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ ）， 子囊菌纲 （ Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ ）， 粪壳菌亚纲 （ Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｉｄａｅ ）， 肉座菌目 （ Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ ）， 丛赤壳科 （ Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａ ）， 丽赤壳属 （ 犆犪犾狅狀犲犮狋狉犻犪 ）。 无性阶段中文名 ： 花生黑腐病菌 ， 寄生帚梗柱孢霉 ， 寄生柱枝孢无性阶段学名 ： 犆狔犾犻狀犱狉狅犮犾犪犱犻狌犿狆犪狉犪狊犻狋犻犮狌犿 Ｃｒｏｕｓ ， Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ＆Ａｌｆｅｎａｓ ， 异名 ： 犆狔犾犻狀犱狉狅犮犾犪犱犻狌犿犮狉狅狋犪犾犪狉犻犪犲 （ Ｌｏｏｓ ） Ｂｅｌｌ＆Ｓｏｂｅｒｓ 犆狔犾犻狀犱狉狅犮犾犪犱犻狌犿狆犪狉犪狊犻狋犻犮狌犿 隶属于有丝分裂孢子真菌类 （ Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃｆｕｎｇｉ ）， 丝孢纲 （ Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ ）， 丝孢目 （ Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ）， 丝孢科 （ Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ ）， 帚梗柱孢属 （ 犆狔犾犻狀犱狉狅犮犾犪犱犻狌犿 ）。 花生黑腐病是典型的土壤传播和种子传播病害 ， 具有危害严重 、 传播迅速和较难防治的特点 。 该病病原菌广泛分布于土壤中 ， 除能为害花生 、 大豆等豆科植物外 ， 还能引起茶树 、 油加利树等植物的叶斑病 。 病菌先侵染子叶使其变黑腐烂 ， 继而侵染幼苗根茎部 。 潮湿环境下 ， 病部长出许多霉状物覆盖茎基部 ， 茎叶失水萎蔫死亡 。 在田间常与花生新赤壳基腐病相混淆 （ 表 Ａ．１ ）。 花生黑腐病菌在 １０℃ ～ ３０℃ 范围内均能生长 ， 最适生长温度为 ２５℃ ～ ２８℃ 。 病菌在世界上的分布 、 寄主植物 、 发病症状及与近似病害的比较等其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 依据花生黑腐病菌在寄主上的症状 、 形态学特征和 ＰＣＲ 特异性扩增等进行检测鉴定 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８２１ — ２０１８ ５ 　 主要仪器设备 ５ ． １ 　 仪器设备 ５ ． １ ． １ 　 生物显微镜 ： 放大倍数 ４０× ～ １０００× 。 ５ ． １ ． ２ 　 体视显微镜 ： 放大倍数 １．９５× ～ ２５０× 。 ５ ． １ ． ３ 　 生物安全柜 ： 符合 ＥＮ１２４６９ ： ２０００ 标准 。 ５ ． １ ． ４ 　 高压灭菌器 ： 灭菌工作温度 １０５℃ ～ １３８℃ 。 ５ ． １ ． ５ 　 光照生物培养箱 ： 温范围 ０℃ ～ ５０℃ ， 温度波动度 ±０．５℃ ， 温度均匀度 ±１℃ ， 光照度 ０ｌｘ ～ ３５００ｌｘ 。 ５ ． ２ 　 试验用具 ５ ． ２ ． １ 　 滤纸 ： 尺寸 １１０ｍｍ ， 等级中速 。 ５ ． ２ ． ２ 　 手持放大镜 ： 放大倍数 １０ 倍 ， 直径 ９０ｍｍ 。 ５ ． ２ ． ３ 　 培养皿 ： 直径 ９０ｍｍ 。 ５ ． ２ ． ４ 　 烧杯 ： １００ｍＬ ， ２５０ｍＬ ， ５００ｍＬ ， １０００ｍＬ ， ２０００ｍＬ 。 ５ ． ２ ． ５ 　 试管 ： １５ｍｍ×１５０ｍｍ 。 ５ ． ２ ． ６ 　 量筒 ： ５００ｍＬ ， １０００ｍＬ 。 ５ ． ２ ． ７ 　 移液器吸头 ： １０ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ 。 ５ ． ２ ． ８ 　 离心管 ： １．５ｍＬ 。 ５ ． ２ ． ９ 　 其他 ： 手术刀 、 手术剪 、 镊子 、 酒精灯 、 研钵 、 载玻片 、 盖玻片 。 ６ 　 试剂和培养基 ６ ． １ 　 试剂 除非另有说明 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的三级水 。 ＰＣＲ 反应体系用双蒸水 。 ６ ． １ ． １ 　 五氯硝基苯 （ Ｃ ６ Ｃｌ ５ ＮＯ ２ ）。 ６ ． １ ． ２ 　 噻菌灵 （ Ｃ １０ Ｈ ７ Ｎ ３ Ｓ ）。 ６ ． １ ． ３ 　 金霉素 （ Ｃ ２２ Ｈ ２３ ＣｌＮ ２ Ｏ ８ ）。 ６ ． １ ． ４ 　 氯霉素 （ Ｃ １１ Ｈ １２ Ｃｌ ２ Ｎ ２ Ｏ ５ ）。 ６ ． １ ． ５ 　 氯硝胺 （ Ｃ ６ Ｈ ４ Ｃｌ ２ Ｎ ２ Ｏ ２ ）。 ６ ． １ ． ６ 　 硫酸链霉素 （ Ｃ ４２ Ｈ ８４ Ｎ １４ Ｏ ３６ Ｓ ３ ）。 ６ ． １ ． ７ 　 ７０％ 乙醇 （ Ｃ ２ Ｈ ５ ＯＨ ）。 ６ ． ２ 　 试剂配制 ６ ． ２ ． １ 　 次氯酸钠溶液 （ ０．２６％ ）： 取有效氯含量为 １０％ 的次氯酸钠溶液 ２５ｍＬ 加水稀释至 １０００ｍＬ 。 ６ ． ２ ． ２ 　 次氯酸钠溶液 （ ０．５％ ）： 取有效氯含量为 １０％ 的次氯酸钠溶液 ４８ｍＬ 加水稀释至 １０００ｍＬ 。 ６ ． ２ ． ３ 　 硫酸链霉素溶液 （ ０．１％ ）： 取 ０．１ｇ 硫酸链霉素加水溶解 ， 并定容至 １００ｍＬ 。 ６ ． ３ 　 培养基 培养基配置方法及步骤见附录 Ｂ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８２１ — ２０１８ ７ 　 鉴定 ７ ． １ 　 取样方法 按 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ — ２０１５ 中 ５．１ 和 ５．２ 规定的取样比例进行取样 。 ７ ． ２ 　 症状检查 症状检查参见附录 Ｃ 。 逐一对取样产品进行症状观察 。 观察收集的寄主植株茎基部和根系是否变黑腐烂 （ 图 Ｃ．８ 、 图 Ｃ．１２ ）， 病株茎基部 、 果针和豆荚是否产生大量成簇橙红色至深红色子囊壳 （ 图 Ｃ．７ ）， 叶片是否有退绿变黄症状 （ 图 Ｃ．８ 、 图 Ｃ．１１ ）。 重点观察花生果荚是否变黑 （ 图 Ｃ．１０ ）， 种皮表面是否有肉桂色或深棕色斑点 （ 图 Ｃ．９ ）， 这些斑点可能是寄生帚梗柱孢霉的菌丝体或微菌核 。 疑似的病残体和病子粒要带回实验室进行显微镜检查和病原菌分离 ， 可轻轻刮取病株表面橙红色子囊壳在体视显微镜下观察 ， 挑取子囊壳制作玻片 ， 轻压后可见大量子囊喷出 （ 图 Ｃ．６ ）。 ７ ． ３ 　 分离培养 ７ ． ３ ． １ 　 种子携带病原分离 将带病斑花生种子先用流水冲洗干净 ， 用无菌接种刀横切成几小块 ， 再用 ０．２６％ 次氯酸钠溶液表面消毒 １ｍｉｎ ， 经灭菌水清洗 ３ 次后移至含有五氯硝基苯 、 噻菌灵 、 金霉素 、 氯霉素 、 氯硝胺的选择性培养基中 ２５℃ 黑暗培养观察 ， 待菌落出现挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化 ， 获得纯化菌株 。 ７ ． ３ ． ２ 　 植株及残体携带病原分离 将采集到的病样冲洗干净 ， 从茎基部病健交界处切下 ５ｍｍ 见方组织 ， 经 ７５％ 乙醇处理 １ｍｉｎ 后 ， 用 ０．５％ 次氯酸钠表面消毒 ３ｍｉｎ ， 在灭菌水中清洗 ３ 次后去除组织表面多余水分 ， 置于加有 ０．１％ 硫酸链霉