书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６８１２ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 犕狅犾犲犮狌犾犪狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳 犘狅狋犪狋狅狔犲犾犾狅狑犱狑犪狉犳狏犻狉狌狊 ２０１８  ０９  １７ /G31 /G32 ２０１９  ０４  ０１ /G33 /G34 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G31 /G32书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、 中华人民共和国福清出入境检验检疫局 、 福建农林大学 、 中国检验检疫科学研究院 。 本标准主要起草人 ： 沈建国 、 蔡伟 、 高芳銮 、 张永江 、 陈细红 、 李敏 、 王宇 、 吴祖建 、 陈寿铃 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６８１２ — ２０１８ 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法 １ 　 范围 本标准规定了马铃薯黄矮病毒 （ 犘狅狋犪狋狅狔犲犾犾狅狑犱狑犪狉犳狏犻狉狌狊 ） 的分子生物学检测方法 。 本标准适用于可能携带马铃薯黄矮病毒的植物及植物产品检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 　 进出境植物及植物产品检疫抽样 ＳＮ ／ Ｔ２９６４ 　 植物病毒检测规范 ＳＮ ／ Ｔ３４５７ 　 植物病毒分子生物学检测规范 ３ 　 马铃薯黄矮病毒基本信息 中文名 ： 马铃薯黄矮病毒学名 ： 犘狅狋犪狋狅狔犲犾犾狅狑犱狑犪狉犳狏犻狉狌狊 ， 缩写 ： ＰＹＤＶ 。 分类地位 ： 弹状病毒科 （ 犚犺犪犫犱狅狏犻狉犻犱犪犲 ）、 细胞核弹状病毒属 （ 犖狌犮犾犲狅狉犺犪犫犱狅狏犻狉狌狊 ）。 马铃薯黄矮病毒的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 马铃薯黄矮病毒的分子生物学特性是制定本检测方法的主要依据 。 ５ 　 仪器 、 用具及试剂 ５ ． １ 　 仪器 高速冷冻离心机 、 电子天平 、 ＰＣＲ 仪 、 荧光 ＰＣＲ 仪 、 水平电泳系统 、 －２０℃ 低温冰箱和 －８０℃ 超低温冰箱 、 凝胶成像分析系统 、 ｐＨ 计 、 微波炉 、 磁力搅拌器 、 恒温水浴锅 、 高压灭菌锅 、 超净工作台等 。 ５ ． ２ 　 用具 可调移液器 （ ２．５ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ， ２０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ） 和可调移液器枪头 、 离心管 、 研钵等 。 ５ ． ３ 　 试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中相关规定 。 ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｂ ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｃ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３６８１２ — ２０１８ ６ 　 抽样和样品制备 ６ ． １ 　 抽样 尽量抽取有病毒危害症状的植物材料 ， ＰＹＤＶ 的危害症状描述参见附录 Ａ ； 抽样方法按照 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 中规定执行 。 ６ ． ２ 　 样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备 ， 具体方法按照 ＳＮ ／ Ｔ２９６４ 和 ＳＮ ／ Ｔ３４５７ 中规定执行 。 ７ 　 检测鉴定 ７ ． １ 　 犚犜犘犆犚 检测 以含 ＰＹＤＶ 材料作为阳性对照 ， 以不含 ＰＹＤＶ 的健康植物组织作为阴性对照 ， 同时以双蒸水代替模板作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｂ 。 如采用商品化一步法试剂盒 ， 则按照试剂盒说明进行 。 ７ ． ２ 　 实时荧光 犚犜犘犆犚 检测 以含 ＰＹＤＶ 材料作为阳性对照 ， 以不含 ＰＹＤＶ 的健康植物组织作为阴性对照 ， 同时以双蒸水代替模板作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行实时荧光 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｃ 。 如采用商品化一步法试剂盒 ， 则按照试剂盒说明进行 。 ８ 　 结果判定 样品检测时 ， 检测流程及结果判定按下述原则进行 ： ——— ＲＴＰＣＲ 初步筛检 ， 若检测结果为阴性 ， 则判定样品不携带 ＰＹＤＶ ； 若检测结果为阳性 ， 则采用 ＰＣＲ 产物序列测定或实时荧光 ＲＴＰＣＲ 进行验证 ； ——— 若验证结果为阳性 ， 则判定样品携带 ＰＹＤＶ ； 若验证结果为阴性 ， 则判定样品不携带 ＰＹＤＶ 。 ９ 　 样品保存与结果记录 ９ ． １ 　 样品保存 经检测确定携带 ＰＹＤＶ 的样品应保存在适合的条件下以备复核 。 种苗 、 叶片等样品保存在 －８０℃ 冰箱中 ； 做好登记和标记工作 ， 保存期限至少 １ 年 。 ９ ． ２ 　 结果记录 记录包括样品来源 、 种类 、 检测时间 、 地点 、 方法和结果 、 检测人员签字 。 ＲＴＰＣＲ 检测应有电泳图片 ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测应有实时荧光结果图片 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６８１２ — ２０１８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 马铃薯黄矮病毒相关资料 犃 ． １ 　 寄主范围 已报道的寄主包括茄科 、 夹竹桃科 、 菊科 、 十字花科 、 唇形科 、 豆科 、 蓼科和玄参科植物 ， 主要自然寄主为马铃薯 （ 犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿 ）。 犃 ． ２ 　 病害症状 侵染马铃薯引起病株矮缩 、 黄化 ， 茎的生长点早期坏死等症状 （ 见图 Ａ．１ ）。 注 ： 引自 ＣｏｒｎｅｌｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ， Ｂｕｇｗｏｏｄ．ｏｒｇ 。 图 犃 ． １ 　 犘犢犇犞 侵染马铃薯引起的症状 犃 ． ３ 　 分布地区 主要分布于加拿大 、 美国 。 犃 ． ４ 　 传播途径 主要经昆虫介体叶蝉 犃犮犲狉犪狋犪犵犪犾犾犻犪狊犪狀犵狌犻狀狅犾犲狀狋犪 、 犃犮犲狉犪狋犪犵犪犾犾犻犪 ｓｐ ． 、 犃犵犪犾犾犻犪犮狅狀狊狋狉犻犮狋犪 传播 ， 也可通过带毒种薯 、 块茎远距离传播 。 犃 ． ５ 　 粒体形态 病毒粒体有包膜 ， 杆菌状或子弹状 ， 大小约 ３８０ｎｍ×７５ｎｍ 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３６８１２ — ２０１８ 犃 ． ６ 　 病毒基因组 负义单链 ＲＮＡ 病毒 ， 全长约 １２８７５ｂｐ 。 ４ 犌犅 ／ 犜 ３６８１２ — ２０１８ 附 　 录 　 犅 （ 规范性附录 ） 犚犜犘犆犚 检测 犅 ． １ 　 试剂 犅 ． １ ． １ 　 Ｔｒｉｚｏｌ 裂解液 。 犅 ． １ ． ２ 　 ５×ＴＢＥ 缓冲液 ： Ｔｒｉｓ 碱 　　　　　　　　　　　　 ５４．０ｇ 硼酸 （ Ｈ ３ ＢＯ ３ ） 　　 ２７．５ｇ０．５ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ （ ｐＨ８．０ ） ２０ｍＬ 补充蒸馏水至 １Ｌ 。 用时加蒸馏水稀释至 ０．５×ＴＢＥ 。 犅 ． １ ． ３ 　 三氯甲烷 。 犅 ． １ ． ４ 　 异丙醇 。 犅 ． １ ． ５ 　 ７５％ 乙醇 。 犅 ． １ ． ６ 　 无水乙醇 。 犅 ． １ ． ７ 　 ＲＴ 缓冲液 。 犅 ． １ ． ８ 　 ｄＮＴＰｓ ： １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 。 犅 ． １ ． ９ 　 ＭＭＬＶＲＴ ： ２００Ｕ ／ μ Ｌ 。 犅 ． １ ． １０ 　 ＲＮａｓｉｎ ： ４０Ｕ ／ μ Ｌ 。 犅 ． １ ． １１ 　 犜犪狇 ＰＣＲｍｉｘ 。 犅 ． １ ． １２ 　 引物序列 ： 根据已报道的 ＰＹＤＶ 基因组序列设计 １ 对用于特异性扩增的引物 。 正向引物 ＰＹＤＶＦ ： ５′ＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＧＧＣＴＴＧＣＡＴ３′ 反向引物 ＰＹＤＶＲ ： ５′ＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＴＣＣＡＣ３′ＰＣＲ 产物大小 ５８８ｂｐ 。 犅 ． ２ 　 犚犜犘犆犚 检测 犅 ． ２ ． １ 　 总 犚犖犃 提取 取 ０．１ｇ 样品组织置于研钵中 ， 加入液氮充分研磨至粉末状后迅速移入 １．５ｍＬ 离心管 ， 再加入 １ｍＬＴｒｉｚｏｌ 裂解液 ， 剧烈震荡摇匀 ３ｍｉｎ ； ４℃ ， １２０００ 犵 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清液 ； 加入三氯甲烷 ３００ μ Ｌ ， 剧烈震荡 １５ｓ ， 室温静置 ５ｍｉｎ ， ４℃ ， １２０００ 犵 离心 １５ｍｉｎ ， 取上层水相 ； 加入等体积的异丙醇 ， 颠倒混匀后室温下静置 １５ｍｉｎ ， ４℃ ， １２０００ 犵 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清液 ； 加入 １ｍＬ７５％ 的乙醇洗涤沉淀 ２ 次 ， 每次 ４℃ ， ７５００ 犵 离心 ３ｍｉｎ ， 弃上清液 ； ＲＮＡ 沉淀干燥后 ， 用 ２０ μ Ｌ ～ ４０