书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３６７８９ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犖狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狀犻犿犪犾狉犪犫犻犲狊狏犻狉狌狊 ２０１８  ０９  １７ /G2D /G2E ２０１９  ０４  ０１ /G2F /G30 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G32 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G33 /G2F /G30 /G34 /G35 /G36 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 军事医学科学院军事兽医研究所 。 本标准主要起草人 ： 冯烨 、 郭焕成 、 许运斌 、 江禹 、 涂长春 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６７８９ — ２０１８ 引 　　 言 　　 本文件的发布机构提请注意 ， 声明符合本文件时 ， 可能涉及 ４．４ 与套式 ＲＴＰＣＲ 检测方法相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性 、 有效性和范围无任何立场 。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证 ， 他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下 ， 就专利授权许可进行谈判 。 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 。 相关信息可以通过以下联系方式获得 ： 专利持有人姓名 ： 江禹 、 涂长春地址 ： 吉林省长春市净月经济开发区柳莺西路 ６６６ 号军事医学科学院军事兽医研究所请注意除上述专利外 ， 本文件的某些内容仍可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３６７８９ — ２０１８ 动物狂犬病病毒核酸检测方法 １ 　 范围 本标准规定了检测动物狂犬病病毒核酸的套式 ＲＴＰＣＲ 和荧光定量 ＲＴＰＣＲ 方法 。 本标准适用于临床疑似狂犬病病毒感染动物脑组织 、 脊髓 、 脑脊液 、 唾液腺 、 唾液以及狂犬病病毒细胞培养物中病毒核酸的检测 （ 参见附录 Ａ ）。 ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＲＴＰＣＲ ： 反转录  聚合酶链式反应 （ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ＤｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ） ＤＥＰＣ ： 焦炭酸乙二酯 （ Ｄｉｅｔｈｙｐｙｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲液 （ ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ ） Ｃｔ 值 ： 达到阈值的循环数 （ ＣｙｃｌｅＴｈｒｅｓｈｏｌｄ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ ） ｄＮＴＰ ： 三磷酸脱氧核糖核苷 （ ＤｅｏｘｙＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅＴｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） 犜犪狇 酶 ： 耐热 ＤＮＡ 聚合酶 （ ＴｈｅｒｍｕｓＡｑｕａｔｉｃｕｓＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） ３ 　 器材和试剂 ３ ． １ 　 器材 ３ ． １ ． １ 　 仪器 ＩＩ 级生物安全柜 、 ４℃ 离心机 、 冰箱 （ －２０℃ ）、 冰柜 （ ４℃ ）、 分析天平 、 ＰＣＲ 扩增仪 、 荧光定量 ＰＣＲ 扩增仪 、 电泳仪 、 电泳槽 、 紫外凝胶成像仪 （ 或紫外分析仪 ）、 微波炉 、 震荡混匀器 、 组织研磨器 、 单道可调移液器 （ １０ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ）。 ３ ． １ ． ２ 　 耗材 手术剪 、 医用镊子 、 称量纸 、 棉签 、 琼脂糖 、 量筒 （ ５００ｍＬ ）、 锥形瓶 （ ５００ｍＬ ）、 一次性无 ＲＮａｓｅ 枪头 （ １０ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ）、 无 ＲＮａｓｅ 离心管 （ １．５ｍＬ ）、 与荧光定量 ＰＣＲ 扩增仪配套的 ＰＣＲ 管 （ ０．２ｍＬ ）、 组织研磨棒 。 ３ ． ２ 　 试剂 ３ ． ２ ． １ 　 总 ＲＮＡ 提取试剂 。 ３ ． ２ ． ２ 　 磷酸盐缓冲液 （ １ｍｏｌ ／ ＬＰＢＳ ， ｐＨ７．４ ）。 配制方法见附录 Ｂ 。 ３ ． ２ ． ３ 　 ＴＡＥ 电泳缓冲液 。 配制方法见附录 Ｂ 。 ３ ． ２ ． ４ 　 其他试剂 ： ２００ＩＵ ／ μ Ｌ 反转录酶 、 １０× 反转录酶缓冲液 、 ４０Ｕ ／ μ ＬＲＮＡ 酶抑制剂 、 ５ＩＵ 犜犪狇 酶 、 １ 犌犅 ／ 犜 ３６７８９ — ２０１８ １０× 犜犪狇 缓冲液 （ 含 Ｍｇ ２＋ ）、 ２．５ｍｍｏｌ ／ ＬｄＮＴＰｓ 、 ５０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 寡聚脱氧胸苷酸引物 ［ Ｏｌｉｇｏ （ ｄＴ ） １５ Ｐｒｉｍｅｒ ］、 ５０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ 随机引物 、 ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 氯化镁 （ ＭｇＣｌ ２ ）、 １０％ 聚乙二醇辛基苯基醚 （ ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ）、 核酸染料 、 上样缓冲液 、 三氯甲烷 、 异丙醇 、 ７５％ 乙醇 、 双蒸水 、 ＤＥＰＣ 水 。 ３ ． ２ ． ５ 　 引物及探针序列 ， 见附录 Ｃ 。 ４ 　 方法 ４ ． １ 　 样品的采集 、 保存和运送 ４ ． １ ． １ 　 对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物 ， 应在死亡后尽早无菌采集脑组织 ， 放入灭菌容器内 ； 对待活检动物 ， 采集脑脊液和唾液拭子 。 生物安全要求见附录 Ｄ 。 ４ ． １ ． ２ 　 将待检样品置于 ２℃ ～ ８℃ 的运输箱内运输 ； 如不能立即运输 ， 可置于样品保存管内 ， －２０℃ 以下保存 ， 保存期间避免反复冻融 。 样品置于 －７０℃ 以下可长期保存 。 ４ ． １ ． ３ 　 新鲜冷藏或冰冻样品均应尽快运送至检测地点 。 ４ ． ２ 　 样品处理 ４ ． ２ ． １ 　 脑组织 、 脊髓和唾液腺 称取 ０．１ｇ 待检动物脑组织 、 脊髓或唾液腺样品 ， 置于离心管中 。 加入 ４００ μ Ｌ１×ＰＢＳ 充分研磨 。 脑组织研磨液经 ４℃３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 取 １００ μ Ｌ 上清放到 １．５ｍＬ 离心管中 ， 待检 。 ４ ． ２ ． ２ 　 唾液拭子样品 将唾液拭子棉签倒置于离心管中 ， ４℃３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 取上清 ２００ μ Ｌ ， 置 １．５ｍＬ 离心管中 ， 待检 。 ４ ． ２ ． ３ 　 脑脊液或细胞培养物样品 取脑脊液样品或细胞培养物 ２００ μ Ｌ ， 置 １．５ｍＬ 离心管中 ， 待检 。 ４ ． ３ 　 核酸提取 ４ ． ３ ． １ 　 提取样品总 ＲＮＡ ， 可采用本标准推荐方法 ， 或选择商业试剂盒 ， 按照试剂盒说明进行 。 ４ ． ３ ． ２ 　 取 １００ μ Ｌ 脑组织 、 脊髓或唾液腺样品悬液上清加入 ９００ μ Ｌ 裂解液 ， 或 ２００ μ Ｌ 脑脊液 、 唾液样品 、 细胞培养物加入 ８００ μ Ｌ 裂解液 ， 剧烈振荡 ３０ｓ ， 静置 ５ｍｉｎ 。 ４ ． ３ ． ３ 　 每个样品管中加 ２００ μ Ｌ 三氯甲烷 ， 振荡 ２０ｓ ， ４℃１２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 ４ ． ３ ． ４ 　 转移 ４．３．３ 中的 ６００ μ Ｌ 上清液至新离心管 ， 加等体积的异丙醇 ， 混匀后 ４℃ 静置 １０ｍｉｎ ， ４℃１００００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 ４ ． ３ ． ５ 　 弃上清液 ， 沉淀中加 １ｍＬ７５％ 乙醇 ， ４℃１２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃上清 ， 留沉淀 ， 将离心管倒置于吸水纸上干燥 。 ４ ． ３ ． ６ 　 将离心管中 ＲＮＡ 沉淀用 １０ μ ＬＤＥＰＣ 水充分溶解 。 ４ ． ４ 　 套式 犚犜犘犆犚 检测方法 ４ ． ４ ． １ 　 对照设立 设置要求 ： 从样品处置开始应设置阳性对照 、 阴性对照 。 阳性对照 ： 取已知阳性的同类样品作为阳性对照 。 也可以将适量灭活的狂犬病病毒添加到已知阴 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６７８９ — ２０１８ 性样品中作为阳性对照 。 阴性对照 ： 取已知阴性的同类样品作为阴性对照 。 采用 ４．３ 的方法提取阳性对照和阳性对照的 ＲＮＡ 。 ４ ． ４ ． ２ 　 反转录 反应体系 ： 以 Ｏｌｉｇｏ （ ｄＴ ） １５ Ｐｒｉｍｅｒ 、 随机引物为引物 ， 建立 ２０ μ Ｌ 反转录体系 。 　　　　　　　 ２．５ｍｍｏｌ ／ ＬｄＮＴＰｓ 　　　　　　　　　　　　　　 ４．０ μ Ｌ 随机引物 （ ５０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ） １．５ μ ＬＯｌｉｇｏ （ ｄＴ ） １５ Ｐｒｉｍｅｒ （ ５０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ） ０．５ μ Ｌ１０× 反转录缓冲液 ４．０ μ Ｌ 反转录酶 １．０ μ ＬＲＮＡ 酶抑制剂 １．０ μ ＬＲＮＡ ８．０ μ Ｌ 反应条件 ： ４２℃ 孵育 １．５ｈ 后 ， ９５℃ 反应 ５ｍｉｎ ， 产物为 ｃＤＮＡ 。 ４ ． ４ ． ３ 　 外套 犘犆犚 反应体系