书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犗犪狋犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 ２０１８  ０９  １７ 发布 ２０１９  ０４  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 、 浙江省农业科学院 、 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、 中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 郭立新 、 段维军 、 梁新苗 、 杨永生 、 孙丽英 、 吴薇 、 荣德福 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ 燕麦花叶病毒检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了燕麦花叶病毒的血清学 、 分子生物学及免疫电镜检测与鉴定方法 。 本标准适用于燕麦属 （ 犃狏犲狀犪 ） 植株 、 种子及种子中夹杂的土壤上的燕麦花叶病毒的检疫和鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＳＮ ／ Ｔ１８４０ 　 植物病毒免疫电镜检测方法 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 　 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 ３ 　 燕麦花叶病毒基本信息 学名 ： 犗犪狋犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 。 异名 ： Ｓｏｉｌｂｏｒｎｅｏａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ 。 缩写 ： ＯＭＶ 。 分类地位 ： 马铃薯 Ｙ 病毒科 （ 犘狋狔狏犻狉犻犱犪犲 ）、 大麦黄花叶病毒属 （ 犅狔犿狅狏犻狉狌狊 ）。 燕麦花叶病毒的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ ＤＡＳＥＬＩＳＡ ）、 反转录聚合酶链式反应 （ ＲＴＰＣＲ ） 及免疫电镜 （ ＩＥＭ ） 检测是本标准制定的主要依据 。 ５ 　 仪器设备和主要试剂 ５ ． １ 　 仪器设备 电子天平 （ 感量 ０．００１ｇ ）、 普通天平 （ 感量 ０．１ｇ ）、 高速冷冻离心机 、 小型离心机 、 超低温冰箱 （ －８０℃ ）、 制冰机 、 旋涡振荡器 、 磁力搅拌器 、 高压灭菌锅 、 ｐＨ 计 、 超净工作台 、 ＰＣＲ 仪 、 电泳仪 、 电泳槽 、 凝胶分析成像系统 、 酶标仪 、 洗板机 、 透射电子显微镜 。 ５ ． ２ 　 主要试剂 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中相关规定 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测试剂见附录 Ｂ ； ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｃ ； ＩＥＭ 检测试剂见 ＳＮ ／ Ｔ１８４０ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ ６ 　 检测样品制备 ６ ． １ 　 种子 抽样按照 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 的规定执行 。 挑取至少 １０００ 粒种子样品 ， 将其分成若干份 ， 每份 ２５ 粒 ～ １００ 粒 。 用灭菌蒸馏水浸泡种子 ， 待种子泡软后 （ 约 １２ｈ ～ ２４ｈ ） 进行试验 。 ６ ． ２ 　 植株 抽样按照 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 的规定执行 。 对于有症状的植株样品编号单独检测 ， 检测时选取全部表现症状的叶片 。 未表现症状的植株样品分组 （ １０ 株为 １ 组 ） 并编号检测 ， 检测时选取幼嫩叶片进行试验 。 ７ 　 检测与鉴定 ７ ． １ 　 犇犃犛犈犔犐犛犃 方法 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测时 ， 将使用的点样孔安排在酶联板内部 ， 避免使用酶联板周围一圈的点样孔 ， 防止边际效应的发生 ， 影响检验结果的准确性 。 在一次血清学检测试验中 ， 一般设置 ２ 个阳性对照孔 、 ２ 个阴性对照孔 、 ２ 个空白对照孔作为质量控制 ， 并根据送检样品数量设置待检样品孔数量 ， 要求每个待检样品设置两次重复 。 具体检测方法见附录 Ｂ 。 ７ ． ２ 　 一步 犚犜犘犆犚 方法 ＲＴＰＣＲ 检测时 ， 每个样品设置两个平行反应 。 检测时以感染燕麦花叶病毒的植物组织作为阳性对照 ， 以健康植物组织作为阴性对照 ， 以双蒸水代替模板作为空白对照 。 具体检测方法见附录 Ｃ 。 ７ ． ３ 　 犐犈犕 检测方法 利用燕麦花叶病毒抗血清富集植物材料中的病毒 ， 在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征 ， 具体检测方法见 ＳＮ ／ Ｔ１８４０ 。 如观察到长 ６００ｎｍ ～ ７５０ｎｍ ， 宽 １２ｎｍ ～ １４ｎｍ 弯曲线状的病毒粒子 ， 即可判定 ＩＥＭ 检测结果阳性 。 ８ 　 结果判定 若样品经酶联免疫检测结果为阳性 ， 且 ＲＴＰＣＲ 检测为阳性或 ＩＥＭ 检测为阳性 ， 则判定为检出燕麦花叶病毒 。 若样品经 ＲＴＰＣＲ 检测为阳性 ， 且序列测定结果与已知燕麦花叶病毒核苷酸序列一致性不低于 ８０％ ， 则判定为检出燕麦花叶病毒 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ ９ 　 样品 、 结果记录与资料保存 ９ ． １ 　 样品保存与处理 经检验确定携带燕麦花叶病毒的样品经登记人和经手人签字后妥善保存 １ 年 ， 以备复核 ， 种子保存在干燥条件下或 ４℃ 冰箱内 ， 病叶冷冻干燥后保存于 －２０℃ 或 －８０℃ 冰箱内 。 保存期满后应经高压蒸汽灭菌后方可处理 。 ９ ． ２ 　 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括 ： 样品的来源 、 种类 、 时间 ， 实验的时间 、 地点 、 方法和结果等 ， 并要有实验人员和审核人员签字 。 酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据 ， ＲＴＰＣＲ 凝胶电泳检测需有电泳结果照片及序列测定结果 ， ＩＥＭ 检测需有电镜照片 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 燕麦花叶病毒其他信息 犃 ． １ 　 病害症状 引起秋播燕麦 （ 犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪 Ｌ． ） 发病 ， 燕麦受燕麦花叶病毒侵染后 ， 最初叶片上出现短的褪绿条纹或条斑 ， 后变为黄斑或叶片萎黄 ， 而随着气温升高 ， 通常会隐症 。 早春田间发病燕麦植株成片矮化 、 褪绿 （ 图 Ａ．１ ）。 耐病品种受燕麦花叶病毒侵染 ， 燕麦产量损失 ２５％ ～ ５０％ ， 易感病品种产量损失高达 １００％ 。 注 ： 引自 ｈｔｔｐ ：／／ ｗｗｗ．ｆｏｒｅｓｔｒｙｉｍａｇｅｓ．ｏｒｇ ／ ｂｒｏｗｓｅ ／ ｄｅｔａｉｌ．ｃｆｍ ？ ｉｍｇｎｕｍ＝１４３６０３４ 图 犃 ． １ 　 燕麦花叶病毒在燕麦上引起的症状 犃 ． ２ 　 寄主范围 寄主范围较窄 ， 只局限于燕麦属 （ 犃狏犲狀犪 ） 作物 。 犃 ． ３ 　 分布 分布于英格兰 、 威尔士 、 爱尔兰 、 意大利 、 法国 、 美国 。 犃 ． ４ 　 粒体形态 病毒粒体为弯曲线状 ， 长 ６００ｎｍ ～ ７５０ｎｍ ， 宽 １２ｎｍ ～ １４ｎｍ （ 见图 Ａ．２ ）。 ４ 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ 注 １ ： 黑色粗线表示 １００ｎｍ 。 注 ２ ： 引自 ＴｏｍｉｏＵ 。 图 犃 ． ２ 　 燕麦花叶病毒粒体形态 犃 ． ５ 　 传播方式 主要通过土壤中的禾谷多黏菌 （ 犘狅犾狔犿狔狓犪犵狉犪犿犻狀犻狊 Ｌ． ） 进行传播 ； 也可通过汁液摩擦接种传播 ， 但较困难 ； 不能通过种子传播 ， 但种子能带毒 ， 带毒的种子在含禾谷多黏菌的土壤中能传播燕麦花叶病毒 。 犃 ． ６ 　 抗原特性 具有中等免疫原性 ， 与其他燕麦属作物病毒无血清学关系 。 犃 ． ７ 　 基因组 二分体基因组 ， 由 ２ 条线形正义核糖核酸 （ ＲＮＡ ） 组成 ， 即 ： ＲＮＡ１ 和 ＲＮＡ２ 。 ＲＮＡ１ 全长为 ７５５０ｎｔ ， 编码产生 １ 个分子质量为 ２６２．８ｋｕ 的多聚蛋白 ， 随后切割成一些功能产物 ， 外壳蛋白 （ ＣＰ ） 在 Ｃ 端 ， 分子量为 ２８．８ｋｕ ； ＲＮＡ２ 长约 ３５００ｎｔ ， 长期摩擦接种可导致其基因缺失突变 。 ５ 犌犅 ／ 犜 ３６７７８ — ２０１８ 附 　 录 　 犅 （ 规范性附录 ） 犇犃犛犈犔犐犛犃 方法 犅 ． １ 　 主要试剂 犅 ． １ ． １ 　 包被抗体 特异性的燕麦花叶病毒抗体 。 犅 ． １ ． ２ 　 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的燕麦花叶病毒抗体 。 犅 ． １ ． ３ 　 底物 对硝基苯磷酸二钠 （ ρ ＮＰＰ ）。 犅 ． １ ． ４ 　 磷酸盐吐温缓冲液 （ 犘犅犛犜 ）（ 洗涤缓冲液 ） 氯化钠 （ ＮａＣｌ ） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ８．０ｇ 磷酸二氢钾 （ ＫＨ ２ ＰＯ ４ ） 　 ０．２ｇ 磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ） 　 １．１５ｇ 氯化钾 （ ＫＣｌ ） 　 ０．２ｇ 吐温 ２０ （ Ｔｗｅｅｎ２０ ） 　 ０．５ｍＬ 溶于蒸馏水 ， 调 ｐＨ 值至 ７．４ ， 蒸馏水定容至 １Ｌ ， ４℃ 冰箱保存 。 犅 ． １ ． ５ 　 包被缓冲液 碳酸钠 （ Ｎａ ２ ＣＯ ３ ） 　 １．５９ｇ 碳酸氢钠 （ ＮａＨＣＯ ３ ） 　 ２．９３ｇ 叠氮化钠 （