书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３６７５２ — ２０１８ 藜草花叶病毒检疫鉴定方法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犛狅狑犫犪狀犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 ２０１８  ０９  １７ 发布 ２０１９  ０４  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国广东出入境检验检疫局 、 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局 、 浙江大学 。 本标准主要起草人 ： 张永江 、 冯黎霞 、 向均 、 廖富荣 、 吴建祥 、 辛言言 、 李桂芬 、 陈青 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６７５２ — ２０１８ 藜草花叶病毒检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法 。 本标准适用于可能带有藜草花叶病毒的植物种子 、 苗木及植物产品的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 　 进出境植物及植物产品检疫抽样 ３ 　 藜草花叶病毒基本信息 学名 ： 犛狅狑犫犪狀犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊 缩写 ： ＳｏＭＶ 分类地位 ： 南方菜豆花叶病毒属 （ 犛狅犫犲犿狅狏犻狉狌狊 ） 成员藜草花叶病毒的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 藜草花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 。 根据 ＳｏＭＶ 与抗体之间的特异性反应 ， 对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ ＤＡＳＥＬＩＳＡ ）； 依据 ＳｏＭＶ 的基因组特征建立 ＲＴＰＣＲ 和实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 ； 通过这些方法的有效组合 ， 判断样品是否带有 ＳｏＭＶ 。 ５ 　 仪器用具与试剂 ５ ． １ 　 仪器 电子天平 （ 感量 ０．００１ｇ ）。 高速冷冻离心机 （ 最大转速 １５０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 小型瞬时离心机 （ 最大转速 ７０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 普通冰箱 （ ４℃ ）。 超低温冰箱 （ －８０℃ ）。 制冰机 （ 每日制冰能力为 １１０ｋｇ ）。 旋涡振荡器 （ 最大转速为 ２８００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 磁力搅拌器 （ 搅拌容量 ５０ｍＬ ～ ２０００ｍＬ ）。 高压灭菌锅 （ 最大压力为 ０．２３５ＭＰａ ， 可调控温度范围为 １０５℃ ～ １３５℃ ）。 ｐＨ 计 （ 量程 ｐＨ０．００ ～ １４．００ ， 精度 ±０．０１ｐＨ ）。 １ 犌犅 ／ 犜 ３６７５２ — ２０１８ 超净工作台 （ 高效滤膜可除去 ９９．９９％ 以上的 ０．３ μ Ｌ 粒子 ）。 ＰＣＲ 仪 （ 温度范围 ４℃ ～ ９９℃ ， 控温精度 ±０．２５℃ ）。 实时荧光 ＰＣＲ 仪 （ 温度范围 ４℃ ～ ９９℃ ， 控温精度 ±０．２５℃ ）。 微波炉 （ 烧烤型 ）。 电泳仪 （ 输出电压 ５Ｖ ～ ６００Ｖ ， 输出电流 ２ｍＡ ～ ２００ｍＡ ）。 凝胶成像分析仪 （ 光强连续可调 ３０２ｎｍ 紫外透照仪 、 顶置白光光源 、 白光转换板 、 ＵＶ 干涉滤光片 、 机载头像捕捉软件 、 图像分析软件 ）。 洗板机 （ 清洗容量 ５０ μ Ｌ ～ ２０００ μ Ｌ ）。 酶标仪 （ 光源波长 ： ２５０ｎｍ ～ ７５０ｎｍ ， 温度范围 ４℃ ～ ９９℃ ）。 ５ ． ２ 　 用具 酶联板 。 可调移液器 （ ２．５ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ， ２０ μ Ｌ ， １００ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ， １０００ μ Ｌ ）。 可调移液器头 。 １．５ｍＬ 离心管 。 研钵 、 微型磨杵等 。 ５ ． ３ 　 试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中相关规定 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 试剂见附录 Ｂ 。 ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｃ 。 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｄ 。 ６ 　 检测样品的制备 ６ ． １ 　 种子样品 挑取畸形种子播于灭菌土中 ， 待长出 ３ 片 ～ ４ 片叶后将表现症状的植株编号 ， 未表现症状的植株分组 （ １０ 株为 １ 组 ） 并编号 ， 采集的叶片分成 ２ 份 ， 根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测 。 也可以挑取畸形 、 不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 。 ６ ． ２ 　 苗木及植物产品 有症状的部分 （ 如叶片畸形 、 花叶 、 斑驳等 ） 单独编号检测 。 没有症状或无法观察症状的植物产品 ， 按照 ＳＮ ／ Ｔ２１２２ 中规定的抽样方法进行抽样 ， 分组编号 、 分组方法和检测方法同 ６．１ 。 ７ 　 检测鉴定 ７ ． １ 　 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ 犇犃犛犈犔犐犛犃 ） 把制备的样品上清液加入已包被 ＳｏＭＶ 抗体的酶联板中 ， 进行 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测 。 每个样品平行加到两个孔中 。 健康的植物组织作为阴性对照 ， 感染 ＳｏＭＶ 的植物组织作为阳性对照 ， 样品提取缓冲液作为空白对照 ； 其中阴性对照的植物种类和材料 （ 如叶片 ） 应尽量与检测样品相一致 。 具体操作见附录 Ｂ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６７５２ — ２０１８ ７ ． ２ 　 犚犜犘犆犚 检测 ＲＴＰＣＲ 检测的阴性和阳性对照设置同 ７．１ ， 灭菌双蒸水作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｃ 。 如采用商品化一步法试剂盒 ， 则按照试剂盒说明进行 。 ７ ． ３ 　 实时荧光 犚犜犘犆犚 检测 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的阴性和阳性对照设置同 ７．１ ， 灭菌双蒸水作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行实时荧光 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｄ 。 如采用商品化一步法试剂盒 ， 则按照试剂盒说明进行 。 ７ ． ４ 　 斑点酶联免疫吸附测定 （ 犇狅狋犈犔犐犛犃 ） 把制备的样品上清液点在硝酸纤维素膜上 ， 进行 ＤｏｔＥＬＩＳＡ 检测 ， 对照设置同 ７．１ 。 具体操作见附录 Ｅ 。 ８ 　 结果判定 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 、 ＤｏｔＥＬＩＳＡ 、 ＲＴＰＣＲ 和实时荧光 ＲＴＰＣＲ 中两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带 ＳｏＭＶ 。 ９ 　 样品保存与结果记录 ９ ． １ 　 样品保存 经检测确定携带 ＳｏＭＶ 的样品应保存在适合的条件下以备复核 。 如种子保存在 ４℃ ， 种苗 、 叶片等样品保存在 －８０℃ 冰箱中 ； 做好登记和标记工作 ， 保存期限至少 １ 年 。 ９ ． ２ 　 结果记录 记录包括样品来源 、 种类 、 检测时间 、 地点 、 方法和结果 、 检测人员签字 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测应有酶联反应数值 ； ＤｏｔＥＬＩＳＡ 检测应有检测图谱 ； ＲＴＰＣＲ 检测应有电泳图片 ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测应有荧光曲线图 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３６７５２ — ２０１８ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 藜草花叶病毒相关资料 犃 ． １ 　 寄主范围 藜草花叶病毒自然寄主为藜科 （ 犆犺犲狀狅狆狅犱犻犪犮犲犪犲 ） 植物 ， 但是欧洲发现很多果树和葡萄也感染藜草花叶病毒 。 有实验证明藜草花叶病毒的葡萄分离物可经实验方法侵染其他科植物 。 具体包括 犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犿狌狉犪犾犲 墙生藜 、 犆 ． 犪犾犫狌犿 藜 、 犆 ． 犪犿犪狉犪狀狋犻犮犾狅犾狅狉 苋色藜 、 犆 ． 狇狌犻狀狅犪 昆诺藜 、 犆 ． 狋狉犻犵狅狀狅狀 藜属一种 、 犃狋狉犻狆犾犲狓犺狅犲狋犲狀狊犻狊 法国菠菜 、 犃 ． 狊狌犫犲狉犲犮狋犪 滨藜属一种 、 犅犲狋犪狏狌犾犵犪狉犻狊 甜菜 、 犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犻狀犱犻犮狌犿 野菊 、 犇犻犪狀狋犺狌狊犮犪狉狔狅狆犺狔犾犾狌狊 麝香石竹 （ 香石竹 ）、 犉犻犮狌狊犪犾狋犻狊狊犻犿犪 高山榕 （ 大叶榕 ）、 犉犻犮狌狊犮犪狉犻犮犪 无花果 、 犕犪犾狌狊狆狌犿犻犾犪 苹果 、 犘狉狌狀狌狊犮犲狉犪狊狌狊 欧洲酸樱桃 、 犘狉狌狀狌狊犱狅犿犲狊狋犻犮犪 洋李 、 犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾犲狉犪犮犲犪 菠菜 、 犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪 葡萄 。 犃 ． ２ 　 危害症状 昆诺藜 ： 系统侵染 ， 叶片斑驳 、 褪绿斑点 ， 畸形 ， 植株矮化 。 苋色藜 ： 系统侵染 ， 叶片斑驳 、 褪绿斑点 ， 畸形 ， 植株矮化 。 菠菜 ： 系统隐症侵染 。 墙生藜 ： 斑驳 。 甜菜 ： 局部隐症侵染 。 犃 ． ３ 　 分布地区 ＳｏＭＶ 是 １９５２ 年在加利福尼亚河边甜菜田里墙生藜 （ 犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犿狌狉犪犾犲 ） 上首次发现的 ， 目前 ＳｏＭＶ 广泛分布于南美 、 中美 、 北美 、 南非 、 澳大利亚 、 保加利亚 、 加拿大 、 意大利 、 日本 、 美国等 。 犃 ． ４ 　 传播方式 ＳｏＭＶ 具有高度的传染性 ， 易于机械传播 ， 在温室中极易传染用作指示植物的藜科植物