书 书 书犐犆犛 ５９ ． ０８０ ． ０１ 犠 ０４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３６４３３ — ２０１８ 纺织品 　 山羊绒和绵羊毛的混合物 犇犖犃 定量分析 　 荧光 犘犆犚 法 犜犲狓狋犻犾犲狊 — 犇犖犃狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犮犪狊犺犿犲狉犲犪狀犱狑狅狅犾犿犻狓狋狌狉犲 — 犉犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱 ２０１８  ０６  ０７ 发布 ２０１９  ０１  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国纺织工业联合会提出 。 本标准由全国纺织品标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２０９ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 上海出入境检验检疫局 、 中纺标检验认证股份有限公司 。 本标准主要起草人 ： 费静 、 谢璐蔓 、 隋阳华 、 斯颖 、 唐敏峰 、 陆维民 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３６４３３ — ２０１８ 纺织品 　 山羊绒和绵羊毛的混合物 犇犖犃 定量分析 　 荧光 犘犆犚 法 １ 　 范围 本标准规定了采用荧光 ＰＣＲ 法测定纺织品中山羊绒 、 绵羊毛的 ＤＮＡ 定量检测方法 。 本标准适用于纺织品混合物中两组分山羊绒 、 绵羊毛含量的检测 。 本标准不适用于回用 、 剥色的山羊绒和绵羊毛纤维 ， 以及安哥拉山羊毛 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１６９８８ 　 特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．１ 　 转基因产品检测 　 通用要求和定义 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．２ 　 转基因产品检测 　 实验室技术要求 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 　 聚合酶链式反应 　 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ； 犘犆犚 在 ＤＮＡ 聚合酶催化下 ， 以母链 ＤＮＡ 为模板 ， 以特定引物为延伸起点 ， 以 ４ 种单核苷酸 （ ｄＮＴＰ ） 为底物 ， 通过变性 、 退火 、 延伸的循环反应 ， 使极少量的 ＤＮＡ 的特定片段 ， 在数小时内扩增出百万倍的 ＤＮＡ 的体外扩增链式反应 。 ３ ． ２ 　 实时荧光定量 犘犆犚 　 狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚 在 ＰＣＲ 反应体系中加入荧光基团 ， 利用荧光信号积累实时监测整个 ＰＣＲ 进程 ， 再通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的 ＤＮＡ 扩增方法 。 ３ ． ３ 　 引物 　 狆狉犻犿犲狉 在核酸合成反应时 ， 作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点并起作用的一小段单链 ＤＮＡ 或 ＲＮＡ 。 ３ ． ４ 　 犜犪狇犕犪狀 探针 　 犜犪狇犕犪狀狆狉狅犫犲 一种荧光基团连接在探针的 ５′ 末端 ， 而淬灭基团则在 ３′ 末端的寡核苷酸链 。 注 ： ＰＣＲ 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针 ， 探针完整时 ， 报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收 ； ＰＣＲ 扩增时 ， 犜犪狇 酶的 ５′３′ 外切酶活性将探针酶切降解 ， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 ， 从 而荧光监测系统可接收到荧光信号 ， 即每扩增一条 ＤＮＡ 链 ， 就有一个荧光分子形成 ， 实现了荧光信号的累积与 １ 犌犅 ／ 犜 ３６４３３ — ２０１８ ＰＣＲ 产物形成完全同步 。 ３ ． ５ 　 犆狋 值 　 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 。 ４ 　 原理 针对山羊 、 绵羊的线粒体 ＤＮＡ 序列设计物种特异的引物和探针 ， 利用实时荧光 ＰＣＲ 技术 ， 建立起山羊绒 、 绵羊毛混合物与它们的 ＤＮＡ 之间的对应关系 。 通过对混合纤维抽提出的 ＤＮＡ 中的山羊成分 、 绵羊成分进行特异性扩增 ， 根据得到的 Ｃｔ 值 ， 计算该样品中山羊绒 、 绵羊毛的相对含量 。 ５ 　 试剂 除非另有说明 ， 在分析中仅使用分析纯试剂 ， 水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 一级水要求 。 ５ ． １ 　 蛋白酶 Ｋ 溶液 ： 称取 １８０ｍｇ 的蛋白酶 （ ＞ ３０Ｕ ／ ｍｇ ）， 溶于 １０ｍＬ 水中 ， 分装后置于 －２０℃ 冻存 。 ５ ． ２ 　 二硫苏糖醇 （ ＤＴＴ ） 溶液 ： 称取 １．５ｇＤＴＴ 溶于 １０ｍＬ 水中 ， 分装后置于 －２０℃ 冻存 。 ５ ． ３ 　 十六烷基三甲基溴化铵 （ ＣＴＡＢ ）： 纯度 ＞ ９８％ 。 ５ ． ４ 　 乙二胺四乙酸 （ ＥＤＴＡ ）： 纯度 ＞ ９８％ 。 ５ ． ５ 　 氯化钠 。 ５ ． ６ 　 氢氧化钠 。 ５ ． ７ 　 三羟甲基氨基甲烷 （ ＴｒｉｓＨＣｌ ）： 纯度 ＞ ９８％ 。 ５ ． ８ 　 苯酚 。 ５ ． ９ 　 三氯甲烷 。 ５ ． １０ 　 ７０％ 冰乙醇 （ 体积分数 ）： －２０℃ 冷藏 。 ５ ． １１ 　 石油醚 。 ５ ． １２ 　 ＣＴＡＢ 裂解液 （ ｐＨ＝８．０ ）： 含有 ２％ＣＴＡＢ （ 质量体积比 ， ｇ ／ Ｌ ）； ０．１ｍｏｌ ／ ＬｔｒｉｓＨＣｌ ； ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ； １．４ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ 。 ５ ． １３ 　 ２×ＴａｑＭａｎ 荧光定量预混液 （ ２×ＴａｑＭａｎｕｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ ）： ４℃ 保存 ， 或其他等效产品 。 警告 ： ２× 犜犪狇犕犪狀狌狀犻狏犲狉狊犪犾犕犪狊狋犲狉犕犻狓 对眼睛和呼吸道有轻微刺激 ， 使用时应采取完善的保护 措施 。 ５ ． １４ 　 引物 、 探针序列信息 ： 见表 １ 。 ６ 　 仪器和器具 ６ ． １ 　 冰箱 ： －２０℃ ～ ４℃ 。 ６ ． ２ 　 天平 ： 分度值 ０．００１ｇ 。 ６ ． ３ 　 空气浴振荡仪 ： 能控制温度 ５６℃±２℃ 。 ６ ． ４ 　 冷冻离心机 ： －２０℃ ～ ４０℃ 。 ６ ． ５ 　 涡旋仪 。 ６ ． ６ 　 微量移液器及吸头 ： ０．２ μ Ｌ ～ ２ μ Ｌ 、 １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ ～ ２０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ６ ． ７ 　 离心管 ： １．５ｍＬ 、 ２．０ｍＬ 。 ６ ． ８ 　 实时荧光 ＰＣＲ 光学反应管或光学 ９６ 孔板 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３６４３３ — ２０１８ ６ ． ９ 　 实时荧光定量 ＰＣＲ 仪 。 ６ ． １０ 　 索氏抽提装置 。 ６ ． １１ 　 液氮冷冻研磨仪 。 ７ 　 取样和试样的预处理 ７ ． １ 　 取样 按照 ＧＢ ／ Ｔ１６９８８ 规定取样品 ， 使其具有代表性 ， 并足以提供全部所需试样 ， 每个试样至少两份 ， 每份试样不少于 ０．２ｇ 。 ７ ． ２ 　 试样的预处理 对于经不溶性浆料 、 树脂等处理过的样品 ， 如果需要可按以下方法进行预处理 。 称取试样 １ｇ 左右 ， 放在索氏萃取器中 ， 用石油醚 （ ５．１１ ） 萃取 １ｈ ， 每小时至少循环 ６ 次 。 待试样中石油醚挥发后 ， 把试样浸入冷水中 ， 浸泡 １ｈ ， 再在 ６５℃±５℃ 水中浸泡 １ｈ ， 浴比为 １００∶１ ， 时时搅拌 ， 然后抽吸或离心脱水 、 晾干 。 如试样上的水不溶性浆料 、 树脂等非纤维物质不能用石油醚和水萃取掉 ， 则要用对纤维组成没有影响的特殊方法处理 。 ８ 　 试验条件 试验条件满足 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．１ 和 ＧＢ ／ Ｔ１９４９５．２ 的规定 。 ９ 　 试验步骤 ９ ． １ 　 标准曲线的建立 使用直径相近的 １００％ 山羊洗净绒 、 １００％ 绵羊洗净毛自制标准混合样 。 分别称取羊绒含量为 １０％ 、 ３０％ 、 ５０％ 、 ７０％ 、 ９０％ ， 总质量为 ０．５ｇ 山羊绒 、 绵羊毛混合物 ， 将它们用液氮冷冻研磨仪 （ ６．１１ ） 粉碎 ， 用以提取 ＤＮＡ 。 按 ９．２ 和 ９．３ 中所述试验步骤进行操作 。 对仪器采集到的针对每个标准混合物的 Ｃｔ 值 ， 求得 Ｃｔ ｃａｓｈｍｅｒｅ －Ｃｔ ｗｏｏｌ 两者的差值 Δ Ｃｔ 为横坐标 ， 以 ｌｇ （ １ ／ ９ ）、 ｌｇ （ ３ ／ ７ ）、 ｌｇ （ ５ ／ ５ ）、 ｌｇ （ ７ ／ ３ ）、 ｌｇ （ ９ ／ １ ） 的值为纵坐标 ， 进行曲线拟合 ， 建立线性的羊绒羊毛定量标准曲线 。 参见附录 Ａ 标准曲线建立的示例 。 ９ ． ２ 　 犇犖犃 的抽提 ９ ． ２ ． １ 　 将所取试样 （ ７．１ ） 用剪刀尽量剪碎至纤维长度 ０．２ｍｍ 以下 ， 也可使用液氮冷冻研磨仪 （ ６．１１ ） 进行研磨 。 ９ ． ２ ． ２ 　 称取试样 ３０ｍｇ ， 并将其置于 ２ｍＬ 的离心管 ， 使用微量移液器 （ ６．６ ） 加入 ０．９ｍＬＣＴＡＢ 裂解液 （ ５．１２ ）， 再加入 ５０ μ Ｌ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ ５．１ ） 及 １５０ μ ＬＤＴＴ 溶液 （ ５．２ ）， 使用涡旋仪 （ ６．５ ） 混匀 。 ９ ． ２ ． ３ 　 将离心管置于 ５６℃ 空气浴振荡仪 （ ６．３ ）， 以 ５００ｒ ／ ｍｉｎ 的速度振荡过夜 （ 至少 ８ｈ ）。 ９