书 书 书犐犆犛 ６７ ． ０５０ 犡 ０４ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５９１７ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 　 /G2D /G2E /G2F /G30 犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀犳狅狉犪狀犻犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊 — 犕犲犿犫狉犪狀犲犫犪狊犲犱犪狉狉犪狔犿犲狋犺狅犱 ２０１８  ０２  ０６ /G31 /G32 ２０１８  ０９  ０１ /G33 /G34 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G31 /G32书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国标准化研究院 、 四川华汉三创生物科技有限公司 、 山东省食品药品检验研究院 、 安徽省食品药品检验研究院 、 安徽出入境检验检疫局 、 滨州市食品药品检验检测中心 、 成都市食品药品检验研究院 、 江西省食品药品检验研究院 、 上海市兽药饲料检测所 。 本标准主要起草人 ： 云振宇 、 李文静 、 霍胜楠 、 吴琦 、 王骏 、 赵琳 、 程潇 、 宗凯 、 马晓蕾 、 祝建华 、 李云飞 、 余晓峰 、 安虹 、 梁恒兴 、 张彪 、 吴鑫 、 商军 、 丁卫平 、 韩家忠 、 曾莲 、 刘菲 、 张红光 、 黄广平 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５９１７ — ２０１８ 常见动物源性成分快速测定 　 膜芯片法 １ 　 范围 本标准规定了常见动物源性成分膜芯片检测方法的原理 、 试剂与仪器设备 、 样品制备与保存 、 试验步骤 、 生物安全措施 、 结果判定 、 结果表述 。 本标准适用于肉制品及饲料中猪 、 黄牛 、 羊 、 鸡 、 兔 、 驴 、 貂 、 狐 、 鼠 、 牦牛 、 鸭共 １１ 种常见动物源性成分的快速定性检测 。 本标准规定的动物源性成分检出限为 ０．１％ （ 质量分数 ）。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ９６９５．１９ 　 肉与肉制品 　 取样方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２０１９５ 　 动物饲料 　 试样的制备 ＧＢ ／ Ｔ２７４０３ 　 实验室质量控制规范 　 食品分子生物学检测 ３ 　 术语 、 定义和缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 聚合酶链式反应 　 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 ； 犘犆犚 在 ＤＮＡ 聚合酶催化下 ， 以母链 ＤＮＡ 为模板 ， 以特定引物为延伸起点 ， 通过变性 、 退火 、 延伸等步骤 ， 体外复制出与母链模板 ＤＮＡ 互补的子链 ＤＮＡ 的过程 。 ３ ． １ ． ２ 多重聚合酶链式反应 　 犿狌犾狋犻狆犾犲狓犘犆犚 在同一 ＰＣＲ 反应体系中加入两对以上引物 ， 同时扩增出多个核酸片段的 ＰＣＲ 反应 。 ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＡｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒＣ６ ： ６ 个碳原子作为连接臂的氨基标记 （ Ｃ６Ａｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒ ） 犃犜犘犪狊犲 ６ ： ＡＴＰ 合成酶亚基 ６ （ ＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅ６ ） ｂｐ ： 碱基对 （ ｂａｓｅｐａｉｒ ） 犮狅狓 １ ： 线粒体细胞色素氧化酶亚基 Ⅰ 基因 （ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ Ⅰ ） 犮狔狋犫 ： 线粒体细胞色素 ｂ 基因 （ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） １ 犌犅 ／ 犜 ３５９１７ — ２０１８ Ｄｌｏｏｐ ： 线粒体 ＤＮＡ 控制区 （ Ｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔｌｏｏｐ ） ｄＡＴＰ ： 脱氧腺苷三磷酸 （ Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 脱氧胞苷三磷酸 （ Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 脱氧鸟苷三磷酸 （ Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 脱氧胸苷三磷酸 （ Ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＵＴＰ ： 脱氧尿苷三磷酸 （ Ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＮＣ ： 阴性对照 （ Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ ） ＰＣ ： 阳性对照 （ Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ ） 犜犪狇 酶 ： 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ 犜犪狇 ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） ＵＮＧ 酶 ： 尿嘧啶 Ｎ 糖基化酶 （ ＵｒａｃｉｌＮｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ） １８ＳｒＲＮＡ 基因 ： 编码 １８Ｓ 核糖体 ＲＮＡ 基因 （ １８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅ ） ４ 　 原理 针对肉制品及饲料中常见动物源性成分特异性基因片段设计引物 ， 对 ＤＮＡ 模板进行多重聚合酶链式反应扩增 ， 扩增产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交 ， 经化学显色后可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号 。 ５ 　 试剂 ５ ． １ 　 试剂组分 试剂组分和存放条件参见附录 Ａ 。 试验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 的要求 。 ５ ． ２ 　 引物 ＰＣＲ 反应使用的引物序列应符合表 １ 的规定 。 表 １ 　 犘犆犚 反应使用的引物序列 物种 目标基因引物名称 序列扩增片段大小 ｂｐ 内参基因 １８ＳｒＲＮＡ 基因 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣ３′ １８０ 猪 犮狅狓 １Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＡＣＣＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＧＴＧ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＴＡＧ３′ １５４ 黄牛 犮狅狓 １Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＴＡＡ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＣＣＧＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＡ３′ １７４ 羊 犮狔狋犫 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＧＣＣＴＡＴＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＡＣ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＡＡＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＴ３′ １５９ 鸡 犮狔狋犫 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＴＡＣＡＣ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＧＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＴＣＡ３′ ７７ ２ 犌犅 ／ 犜 ３５９１７ — ２０１８ 表 １ （ 续 ） 物种 目标基因引物名称 序列扩增片段大小 ｂｐ 兔 犮狔狋犫 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＡＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＡＡＧＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧ３′ ９６ 驴 犮狔狋犫 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＧＡＧＣＡＡＣＧＧＴＣＡＴＴＡＣＡＡＡ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＧＧＴＡＧＡＡＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡ３′ １３４ 貂 犮狔狋犫 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＣＴＡＧＣＡＧ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＴＡＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴ３′ １０７ 狐 犮狅狓 １Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＴＴＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＴＴＣＣＣＣＴＴ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＡＴＡＴ３′ ９３ 鼠 犮狔狋犫 Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＡＣＡＴＡＣＧＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＣ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＴＣＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＡＡ３′ １０７ 牦牛 ＤｌｏｏｐＦｏｒｗａｒｄ５′ＣＴＡＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＴＴＡＴＧＴＡＣＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴ３′ １７６ 鸭 犃犜犘犪狊犲 ６Ｆｏｒｗａｒｄ５′ＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＧＡＡ３′ Ｒｅｖｅｒｓｅ５′ｂｉｏｔｉｎＴＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣ３′ １８０ ５ ． ３ 　 阳性寡核苷酸单链 犇犖犃 序列 阳性寡核苷酸单链 ＤＮＡ 序列应与阳性对照核酸探针 （ ＰＣ ） 序列互补 ， ５′ 端带生物素 （ ｂｉｏｔｉｎ ） 标记 ， 浓度为 １０ μ ｍｏｌ ／ Ｌ ， 用于膜芯片杂交过程质量控制 。 序列如下 ： ５′ｂｉｏｔｉｎＣＴＧＧＴＡＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＡＴＴＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣ３′ ５ ． ４ 　 探针 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表 ２ 的规定 。 表 ２ 　 目标基因探针序列 名称 序列 １８ＳｒＲＮＡ 基因 ５′ＡｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒＣ６ＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧ