书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５９０８ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犮犺犪犾犽犫狉狅狅犱狅犳犺狅狀犲狔犫犲犲狊 ２０１８  ０２  ０６ /G2A /G2B ２０１８  ０９  ０１ /G2C /G2D /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2A /G2B目 　　 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… １ 　 范围 １ ……………………………………………………………………………………………………… ２ 　 规范性引用文件 １ ………………………………………………………………………………………… ３ 　 缩略语 １ …………………………………………………………………………………………………… ４ 　 试剂和材料 １ ……………………………………………………………………………………………… 　 ４．１ 　 水 １ …………………………………………………………………………………………………… 　 ４．２ 　 固定液 、 染色液和培养基 １ …………………………………………………………………………… 　 ４．３ 　 ＰＣＲ 检测方法试剂 １ ………………………………………………………………………………… 　 ４．４ 　 引物序列及对照样品 １ ……………………………………………………………………………… ５ 　 仪器设备 ２ ………………………………………………………………………………………………… ６ 　 临床诊断 ２ ………………………………………………………………………………………………… 　 ６．１ 　 流行病学 ２ …………………………………………………………………………………………… 　 ６．２ 　 箱外观察 ２ …………………………………………………………………………………………… 　 ６．３ 　 开箱检查 ２ …………………………………………………………………………………………… 　 ６．４ 　 结果判定 ２ …………………………………………………………………………………………… ７ 　 实验室诊断 ２ ……………………………………………………………………………………………… 　 ７．１ 　 采样 ２ ………………………………………………………………………………………………… 　 ７．２ 　 镜检法 ３ ……………………………………………………………………………………………… 　 ７．３ 　 分离培养 ３ …………………………………………………………………………………………… 　 ７．４ 　 ＰＣＲ 检测 ４ …………………………………………………………………………………………… ８ 　 综合判定 ５ ………………………………………………………………………………………………… 附录 Ａ （ 规范性附录 ） 　 固定液 、 染色液和培养基配方 ６ …………………………………………………… 附录 Ｂ （ 规范性附录 ） 　 ＰＣＲ 检测方法试剂的配方 ７ ……………………………………………………… 附录 Ｃ （ 资料性附录 ） 　 蜜蜂白垩病发病蜂群的巢门前死虫和病虫症状 ９ ……………………………… 附录 Ｄ （ 资料性附录 ） 　 蜜蜂白垩病发病蜂群的病脾状态 １０ ……………………………………………… 附录 Ｅ （ 资料性附录 ） 　 蜂球囊菌的光镜下显微图像 １１ …………………………………………………… 附录 Ｆ （ 资料性附录 ） 　 蜂球囊菌 ＰＣＲ 产物电泳图 １３ …………………………………………………… 附录 Ｇ （ 资料性附录 ） 　 蜂球囊菌 ＰＣＲ 产物参考序列 １４ ………………………………………………… 犌犅 ／ 犜 ３５９０８ — ２０１８ 前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、 中华人民共和国吉林出入境检验检疫局 、 福建农林大学 、 福建赛福食品检测研究所有限公司 。 本标准主要起草人 ： 郑腾 、 张体银 、 宋战昀 、 黄少康 、 李宋钰 、 张志灯 、 陈日春 、 王武军 、 白泉阳 、 林素洁 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５９０８ — ２０１８ 蜜蜂白垩病诊断技术 １ 　 范围 本标准规定了蜜蜂白垩病的诊断技术 。 本标准适用于蜜蜂白垩病诊断和病原检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ１９４８９ 　 实验室 　 生物安全通用要求 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＥＢ ： 溴化乙锭 （ Ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＳＤＳ ： 十二烷基硫酸钠 （ Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 水 本标准所用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中一级水的规格要求 。 ４ ． ２ 　 固定液 、 染色液和培养基 乳酸苯酚固定液 （ 配方见附录 Ａ 中的 Ａ．１ ）、 乳酸棉蓝染色液 （ 配方见 Ａ．２ ）、 病原菌分离培养基 （ 配方见 Ａ．３ ）。 ４ ． ３ 　 犘犆犚 检测方法试剂 亚精胺 ＳＤＳ 缓冲液 （ 配方见附录 Ｂ 中的 Ｂ．１ ）、 饱和酚 、 氯仿 、 ３ｍｏｌ ／ Ｌ 的醋酸钠 （ ｐＨ５．５ ）（ 配方见 Ｂ．２ ）、 ＴＥ 缓冲液 （ 配方见 Ｂ．３ ）、 ０．５×ＴＢＥ 缓冲液 （ 配方见 Ｂ．４ ）、 上样缓冲液 （ 配方见 Ｂ．５ ）、 １．５％ 琼脂糖凝胶 （ 配方见 Ｂ．６ ）、 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 （ ５Ｕ ／ μ Ｌ ）、 １０×ＰＣＲ 缓冲液 、 ｄＮＴＰＭｉｘ （ １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ）。 ４ ． ４ 　 引物序列及对照样品 上游引物 （ Ｆ ）： ５′ＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＡＧＧＴＧ３′ ； 下游引物 （ Ｒ ）： ５′ＧＡＷＣＡＣＧＡＣＧＣＣＧＴＣＡＣＴ３′ ； 扩增产物为 ４４２ｂｐ 。 蜜蜂蜂球囊菌阳性对照 ， 由指定单位提供或合成含有阳性片段的质粒 。 蜜蜂蜂球囊菌阴性对照 ， 可以选用健康且无白垩病临床症状的幼虫作为阴性对照 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３５９０８ — ２０１８ ５ 　 仪器设备 ５ ． １ 　 光学显微镜 。 ５ ． ２ 　 恒温培养箱 （ ３５℃±１℃ ）。 ５ ． ３ 　 Ａ２ 型二级生物安全柜 。 ５ ． ４ 　 冰箱 （ ２℃ ～ ８℃ 和 －２０℃ ）。 ５ ． ５ 　 ＰＣＲ 仪 。 ５ ． ６ 　 电泳仪 。 ５ ． ７ 　 冷冻离心机 。 ５ ． ８ 　 凝胶成像系统 。 ６ 　 临床诊断 ６ ． １ 　 流行病学 西方蜜蜂的幼虫易患蜜蜂白垩病 ， 病虫和病菌污染的饲料 、 蜂具是主要的传染源 。 菌丝和孢子均具有侵染性 ， 它们可由成年蜂或蜂螨体表携带并在蜂群内或蜂群间传播 。 白垩病主要引起老熟幼虫和封盖幼虫死亡 ， ３ 日龄 ～ ４ 日龄雄蜂幼虫和 ４ 日龄 ～ ５ 日龄工蜂幼虫最易感染白垩病 ， 蜂场内蜂群的发病率可达 １０％ ～ ５０％ ， 幼虫感染率为 ５％ ～ ４０％ ， 成年蜂虽不易感染 ， 但是病原的携带者和传播者 。 白垩病的发生有明显的季节性 ， 多发生在春夏的 ６ 月 ～ ８ 月高温 、 高湿季节 。 凡是日照长 、 地势高燥的地方 ， 白垩病发病率低 ， 一般为 ３％ ～ ５％ ， 或根本不发病 ； 而气温高 、 湿度大 、 光照不足的地方 ， 白垩病危害严重 。 ６ ． ２ 　 箱外观察 患病蜂群的巢门口可见被工蜂拖出的幼虫干尸 ， 质硬 ， 有的干尸呈苍白色 ， 似葵花仁状 ， 表面有一层绒毛膜 ， 掰开幼虫干尸可见内心为浅棕色 ； 有的干尸为部分或全部黑色 ， 似西瓜子状 ， 表面有一层黑色颗粒状物质 。（ 参见附录 Ｃ ） ６ ． ３ 　 开箱检查 从患病蜂群中提出封盖子脾 ， 在已封盖的部分有呈星点式分布被工蜂咬开的巢房 ， 可见内有向一侧贴壁的幼虫干尸 ， 形态完整 ， 质地柔韧 ， 无光泽 ， 无臭味 ， 用镊子取出后 ， 可见有的为白色 ， 有的为部分或全部黑色 。 健康的蜜蜂幼虫是呈有光泽 、 珍珠样外观 。（ 参见附录 Ｄ ） ６ ． ４ 　 结果判定 结合该病的流行特点 ， 若蜂群出现 ６．１ 和 ６．２ 的典型症状 ， 即可判定为临床诊断阳性 。 ７ 　 实验室诊断 ７ ． １