书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５９０６ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 犈犔犐犛犃 /G27 /G28 /G29 /G2A 犐狀犱犻狉犲犮狋犈犔犐犛犃狋狅犱犲狋犲犮狋犪狀狋犻犫狅犱狔犪犵犪犻狀狊狋犮犾犪狊狊犻犮犪犾狊狑犻狀犲犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊 ２０１８  ０２  ０６ /G2B /G2C ２０１８  ０９  ０１ /G2D /G2E /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2B /G2C书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国兽医药品监察所 。 本标准主要起草人 ： 王琴 、 徐璐 、 范学政 、 赵启祖 、 邹兴启 、 朱元源 、 宁宜宝 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５９０６ — ２０１８ 引 　　 言 　　 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒在牛的感染比较严重 ， 偶尔也有猪自然感染的报道 。 在田间 ， 牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒通常对出生后的猪无致病性 ， 仅对胎猪有致病性 。 虽然牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒可在猪群中传播 ， 但这种传播是很有限的 。 在没有新的传染源引入的前提下 ， 猪群中已经存在的牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒会被逐渐清除 ， 病毒的传染链会终止 。 牛源牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒是猪感染牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒的主要来源 ， 主要与牛猪混养程度或使用了污染牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒的牛源材料有关 。 在我国生猪饲养的主力主要为大中型养殖场 ， 很少存在猪牛混养情况 ， 因此不会导致牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒在猪群中的流行传播 。 另外 ， 猪用疫苗生产中的所使用的牛源原材料均需进行牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒等外源病毒检测 ， 因此 ， 疫苗生产工艺的提高也彻底切断了牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒在猪群中传播途径 。 最后 ， 猪瘟疫苗在我国的免疫率接近 １００％ 。 而猪瘟病毒与牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病病毒为同属病毒 ， 免疫上存在一定的交叉保护 。 猪群中存在牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病抗体阳性的可能性微乎其微 。 因此 ， 本标准主要针对猪群中猪瘟疫苗免疫后的抗体检测 ， 不用于对个体进行猪瘟抗体和牛病毒性腹泻 ／ 粘膜病抗体的鉴别检测 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３５９０６ — ２０１８ 猪瘟抗体间接 犈犔犐犛犃 检测方法 １ 　 范围 本标准规定了猪瘟抗体的间接 ＥＬＩＳＡ 检测方法 。 本标准适用于猪瘟抗体检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡标注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文 件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 兽医实验室生物安全技术管理规范 （ 中华人民共和国农业部公告第 ３０２ 号 ） ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＣＳＦＶ ： 猪瘟病毒 （ ＣｌａｓｓｉｃａｌＳｗｉｎｅＦｅｖｅｒＶｉｒｕｓ ） ＥＬＩＳＡ ： 酶联免疫吸附试验 （ ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ ） ＨＲＰ ： 辣根过氧化物酶 （ ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ） ＯＤ ： 光密度 （ ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ ） ４ 　 试剂 ４ ． １ 　 猪瘟病毒 Ｅ２ 蛋白 ： 见附录 Ａ 。 ４ ． ２ 　 标准阳性血清 ： 猪瘟疫苗免疫仔猪制备 ， 荧光抗体病毒中和试验检测中和抗体效价 ≥ １∶２０４８０ 。 ４ ． ３ 　 标准阴性血清 ： 无母源抗体 、 未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清 ， 荧光抗体病毒中和试验病毒抗体检测为 阴性 。 ４ ． ４ 　 酶结合物 ： 商品化的 ＨＲＰ 标记的抗猪 ＩｇＧ 抗体 ， 工作浓度参照产品说明书 。 ４ ． ５ 　 包被液 ： 见附录 Ｂ 中的 Ｂ．１ 。 ４ ． ６ 　 磷酸盐缓冲液 ： 见 Ｂ．２ 。 ４ ． ７ 　 封闭液 ： 见 Ｂ．３ 。 ４ ． ８ 　 １× 洗涤液 ： 见 Ｂ．４ 。 ４ ． ９ 　 稀释液 ： 见 Ｂ．５ 。 ４ ． １０ 　 底物液 Ａ ： 见 Ｂ．６ 。 ４ ． １１ 　 底物液 Ｂ ： 见 Ｂ．７ 。 ４ ． １２ 　 终止液 ： 见 Ｂ．８ 。 ４ ． １３ 　 商品化试剂盒 ： 可选择同类的商品化试剂盒 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３５９０６ — ２０１８ ５ 　 器材和设备 ５ ． １ 　 ３７℃ 温箱 。 ５ ． ２ 　 酶标仪 。 ５ ． ３ 　 各种规格的微量移液器 （ ２０ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ） 和吸头 。 ５ ． ４ 　 多道移液器 （ ２００ μ Ｌ ）。 ５ ． ５ 　 酶联反应板 。 ５ ． ６ 　 血清稀释板 ： ９６ 孔一次性 Ｕ 型血凝板或 ９６ 孔细胞培养板 。 ５ ． ７ 　 一次性注射器 （ ５ｍＬ ～ １０ｍＬ ）。 ６ 　 血清样本的采集及处理 ６ ． １ 　 样本采集及处理 采集静脉血时 ， 每头猪使用一个注射器 。 建议进行前腔静脉或耳静脉无菌采血 ， 不少于 ２ｍＬ 。 室温静置于斜面 ２ｈ ， 待血液自然凝固后 ， 置 ２℃ ～ ８℃ 冰箱中放置不少于 ２ｈ ， ４０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 用移液器小心吸出上层血清 。 ６ ． ２ 　 血清样本的存放与运送 血清样本若在一周内检测 ， 可置 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存 。 若超过一周检测 ， 应置 －２０℃ 以下冷冻保存 。 运输时注意冷藏 ， 确保样品有效 。 采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输 ， 运输时间应尽量缩短 。 按照 《 兽医实验室生物安全技术管理规范 》 进行样品的生物安全标识 。 ７ 　 操作步骤 ７ ． １ 　 包被 ： 用包被液将猪瘟病毒 Ｅ２ 蛋白稀释至 ０．２５ μ ｇ ／ ｍＬ ， 按 １００ μ Ｌ ／ 孔加入到酶联反应板中 ， ２℃ ～ ８℃ 包被 １６ｈ 。 包被结束后 ， 弃去孔中液体 ， 每孔加入 １× 洗涤液 ３００ μ Ｌ ， 洗涤 １ 次 。 ７ ． ２ 　 封闭 ： 每孔加入新鲜配制的封闭液 ３００ μ Ｌ ， ２℃ ～ ８℃ 封闭 ２４ｈ 。 封闭结束后 ， 弃去孔中液体 ， 每孔加入 １× 洗液 ３００ μ Ｌ ， 洗涤 １ 次 ， 即为抗原包被板 。 抗原包被板若不及时使用 ， 则可将孔中液体在吸水材料上拍干 ， 于室温中干燥 （ 温度 ２５℃±２℃ ， 湿度 ≤ ４０％ ） １ｈ 。 装于铝箔袋中 ， 抽真空 ， 置于 ２℃ ～ ８℃ 保存备用 。 ７ ． ３ 　 加稀释液 ： 进行血清检测时 ， 向抗原包被板中加入稀释液 ， ５０ μ Ｌ ／ 孔 。 ７ ． ４ 　 血清的稀释和加样 ： 将待检血清 、 标准阴性 、 阳性对照血清于血清稀释板中分别作 １∶５０ 稀释后 ， 按位序分别向抗原包被板中加入稀释后的样本 ， ５０ μ Ｌ ／ 孔 ， 其中标准阴 、 阳性对照血清各加 ２ 孔 。 充分混匀后 ， ３７℃ 温箱中反应 ３０ｍｉｎ 。 吸取不同血清时需要更换吸头 。 ７ ． ５ 　 洗涤 ： 弃去孔中液体 ， 每孔加入 ３００ μ Ｌ 洗涤液 ， 室温放置 ３ｍｉｎ ， 洗涤 ３ 次 ， 甩干洗涤液 。 ７ ． ６ 　 加酶结合物和孵育 ： 用稀释液将酶结合物稀释至工作浓度 ， 向每反应孔加入 １００ μ Ｌ 。 ３７℃ 温箱孵育 ３０ｍｉｎ 。 ７ ． ７ 　 洗涤 ： 同 ７．５ 。 ７ ． ８ 　 加底物和显色 ： 将底物液 Ａ 和底物液 Ｂ 等体积混合 ， 混合后立即加入到抗原包被板中 ， 每孔 １００ μ Ｌ ， 室温避光显色 １０ｍｉｎ ， 每孔加入 １００ μ Ｌ 终止液 （ 见 Ｂ．８ ）。 ７ ． ９ 　 每孔加入终止液 １００ μ Ｌ 。 ７ ． １０ 　 在酶联免疫检测仪 ４５０ｎｍ 波长处读取各孔的 ＯＤ 值数 ， 并以 ６２０ｎｍ 或 ６５０ｎｍ 作为背景参考波 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５９０６ — ２０１８ 长 ， 以去除背景值 ， １５ｍｉｎ 内完成 。 样本 ＯＤ 值 ＝ＯＤ ４５０ｎｍ －ＯＤ ６２０ｎｍ ／ ６５０ｎｍ 。 ７ ． １１ 　 结果计算 ： 阴性对照平均值见式 （ １ ）： 珡 犖 ＝ （ 犖 １ ＋ 犖 ２ ） ２ …………………………（ １ ） 式中 ： 珡 犖 ——— 阴性对照孔平均值 ； 犖 １ ——— 阴性对照孔 １ 的 ＯＤ 值 ； 犖 ２ ——— 阴性对照孔 ２ 的 ＯＤ 值 。 阳性对照平均值见式 （ ２ ）： 珚 犘 ＝ （ 犘 １ ＋ 犘 ２ ） ２ …………………………（ ２ ） 式中 ： 珚 犘 ——— 阳性对照孔平均值 ； 犘 １ ——— 阳性对照孔 １ 的 ＯＤ 值 ； 犘 ２ ——— 阳性对照孔 ２ 的 ＯＤ 值 。 阳性率见式 （ ３ ）： ＩＥ＝ 犛 珚 犘