书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５９００ ． １ — ２０１８ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 １ /G28 /G29 ： 犎 １ /G2A /G2B /G23 /G24 /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 犚犜犘犆犚 /G25 /G26 /G32 /G33 犃狀犻犿犪犾犻狀犳犾狌犲狀狕犪犱犲狋犲犮狋犻狅狀 — 犘犪狉狋 １ ： 犕犲狋犺狅犱狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚犳狅狉狋犺犲犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犎 １ 狊狌犫狋狔狆犲犻狀犳犾狌犲狀狕犪狏犻狉狌狊 ２０１８  ０２  ０６ /G34 /G35 ２０１８  ０９  ０１ /G36 /G37 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G34 /G35书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ３５９００ 《 动物流感检测 》 目前分为 ３ 个部分 ： ——— 第 １ 部分 ： Ｈ１ 亚型流感病毒核酸荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 ； ——— 第 ２ 部分 ： Ｈ３ 亚型流感病毒核酸荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 ； ——— 第 ３ 部分 ： Ｈ１ 和 Ｈ３ 亚型流感病毒核酸双重荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ３５９００ 的第 １ 部分 。 本部分按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本部分由中华人民共和国农业部提出 。 本部分由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本部分起草单位 ： 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、 中国农业大学 。 本部分主要起草人 ： 乔彩霞 、 谷强 、 高志强 、 刘环 、 蒲静 、 张鹤晓 、 刘金华 、 孙洪磊 、 张伟 、 张利峰 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５９００ ． １ — ２０１８ 引 　　 言 　　 本文件的发布机构提请注意 ， 声明符合本文件时 ， 可能涉及到本文件 ４．１．８ 与 “ 检测 Ｈ１ 和 Ｈ３ 亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒 ” 相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性 、 有效性和范围无任何立场 。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证 ， 他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下 ， 就专利授权许可进行谈判 。 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 。 相关信息可以通过以下联系方式获得 ： 专利持有人 ： 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 。 地址 ： 北京市朝阳区甜水园街 ６ 号 。 请注意除上述专利外 ， 本文件的某些内容仍可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３５９００ ． １ — ２０１８ 动物流感检测第 １ 部分 ： 犎 １ 亚型流感病毒核酸荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ３５９００ 的本部分规定了检测 Ｈ１ 亚型流感病毒核酸的荧光 ＲＴＰＣＲ 操作方法 。 本部分适用于猪和禽及其产品中 Ｈ１ 亚型流感病毒核酸的检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１９４３８．１ — ２００４ 　 禽流感病毒通用荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法 ＧＢ１９４８９ 　 实验室 　 生物安全通用要求 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 荧光 ＲＴＰＣＲ 　 实时荧光反转录聚合酶链反应 （ ｒｅａｌｔｉｍｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） 犆狋 （ 或 犆狆 ） 值 　 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数 （ ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ， ｏｒｃｒｏｓｓｉｎｇｐｏｉｎｔ ） ｃＲＮＡ 互补 ＲＮＡ （ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔＲＮＡ ） ＤＥＰＣ 焦碳酸二乙酯 （ ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ） ＦＡＭ 羧基荧光素 （ ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ） ＬＮＡ 锁核酸 （ ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＰＢＳ 磷酸盐缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ ） ＲＮＡ 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＴＡＭＲＡ 羧基四甲基罗丹明 （ ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ） ４ 　 试剂和材料 ４ ． １ 　 试剂 ４ ． １ ． １ 　 总则 ： 除非另有说明 ， 所用试剂均为分析纯 ， 所用液体试剂均需使用无 ＲＮＡ 酶的容器进行分装 。 ４ ． １ ． ２ 　 ＴＲＩｚｏｌ ： ２℃ ～ ２５℃ 保存 。 ４ ． １ ． ３ 　 氯仿 ： ２℃ ～ ８℃ 预冷 。 ４ ． １ ． ４ 　 异丙醇 ： －２０℃ 预冷 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３５９００ ． １ — ２０１８ ４ ． １ ． ５ 　 ＤＥＰＣ 水 ： 见附录 Ａ 中 Ａ．１ 。 ４ ． １ ． ６ 　 ７５％ 乙醇 ： 用新开启的无水乙醇和 ＤＥＰＣ 水配制 ， －２０℃ 预冷 。 ４ ． １ ． ７ 　 ＰＢＳ （ 含牛血清白蛋白 、 青霉素和链霉素 ）： 配方见 Ａ．２ 。 ４ ． １ ． ８ 　 引物 、 探针序列及反应液配方 ： 见附录 Ｂ 。 ４ ． １ ． ９ 　 阳性对照为灭活的 Ｈ１ 亚型动物流感病毒或体外转录的 Ｈ１ 亚型流感病毒 ＨＡ 基因 ｃＲＮＡ 溶液 ； 阴性对照为已知流感病毒阴性的动物组织悬液 。 ４ ． ２ 　 仪器设备及耗材 ４ ． ２ ． １ 　 荧光 ＰＣＲ 检测仪及配套反应管 （ 板 ）。 ４ ． ２ ． ２ 　 高速台式冷冻离心机 （ 最高离心速度不低于 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ ）。 ４ ． ２ ． ３ 　 台式离心机 。 ４ ． ２ ． ４ 　 振荡器 。 ４ ． ２ ． ５ 　 组织匀浆器 。 ４ ． ２ ． ６ 　 冰箱 （ ２℃ ～ ８℃ 和 －２０℃ 两种 ）。 ４ ． ２ ． ７ 　 微量移液器 （ ５ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ） 及配套吸头 （ 无核酸酶 ）。 ４ ． ２ ． ８ 　 １．５ｍＬ 离心管 （ 无核酸酶 ） 和 ５ｍＬ 采样管 。 ５ 　 实验室的标准化设置与生物安全管理 本方法的实验室设置与管理见 ＧＢ ／ Ｔ１９４３８．１ — ２００４ 附录 Ｃ ； 实验室生物安全管理见 ＧＢ１９４８９ 。 ６ 　 样品的采集与前处理 ６ ． １ 　 总则 采样过程中样本不得交叉污染 ， 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套 。 ６ ． ２ 　 采样及处理工具 ６ ． ２ ． １ 　 采样专用商品化棉拭子 、 剪刀 、 镊子 、 研钵 、 ５ｍＬ 采样管 、 一次性采样袋 。 ６ ． ２ ． ２ 　 除棉拭子和采样袋外 ， 上述取样工具应经 １２１℃±２℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌并烘干或经 １６０℃ 干烤 ２ｈ 。 ６ ． ３ 　 样品采集 ６ ． ３ ． １ 　 拭子样品 活动物采集拭子样品 。 根据动物种类可采集咽喉拭子 、 泄殖腔拭子 （ 禽类 ） 或鼻拭子 （ 猪 ）。 采集方法如下 ： ——— 取咽喉拭子时将拭子深入喉头及上颚裂来回刮 ２ 次 ～ ３ 次并旋转 ， 取分泌液 ； ——— 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便 ； ——— 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮 ２ 次 ～ ３ 次并旋转 ， 取分泌物 。 将采样后的拭子放入盛有 ２．０ｍＬＰＢＳ （ 含牛血清白蛋白 、 青霉素和链霉素 ） 的采样管中 ， 编号 。 ６ ． ３ ． ２ 　 组织样品 病死动物采集肺脏或气管等组织 。 用无菌剪 、 镊采集待检组织 ， 装入一次性采样袋或其他灭菌容 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５９００ ． １ — ２０１８ 器 ， 编号 。 ６ ． ４ 　 样品贮运 样品采集后置保温箱中 ， 加入预冷的冰袋 ， 密封 ， ２４ｈ 内送实验室 。 ６ ． ５ 　 样品处理 ６ ． ５ ． １ 　 拭子样品 样品在振荡器上充分混合后 ， 将拭子中的液体挤出 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ ， 吸取上清液 １．０ｍＬ 转入无菌的 １．５ｍＬ 离心管中 ， 编号备用 。 ６ ． ５ ． ２ 　 组织样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 ２．０ｇ 于研钵或组织匀浆器中充分研磨 ， 再加 １０．０ｍＬＰＢＳ （ 含牛血清白蛋白 、 青霉素和链霉素 ） 混匀 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 后 ， 取 １．０ｍＬ 上清液转入无菌 １．５ｍＬ 灭菌离心管中 ， 编号备用 。 ６ ． ６ 　 样品存放 采集或处理好的样品在 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存应不超过 ２４ｈ ； 若需长期保存 ， 应放置 －７０℃ 冰箱 ， 但应避免反复冻融 （ 冻融不超过 ３ 次 ）。 ７ 　 操作方法 ７ ． １ 　 样品核酸提取 ７ ．