书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犆 ２７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀狋犺狉狅犿犫犻狀 ２０１７  １２  ２９ /G27 /G28 ２０１８  ０７  ０１ /G29 /G2A /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G27 /G28目 　　 次 前言 Ⅰ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅱ ………………………………………………………………………………………………………… １ 　 范围 １ ……………………………………………………………………………………………………… ２ 　 规范性引用文件 １ ………………………………………………………………………………………… ３ 　 术语和定义 １ ……………………………………………………………………………………………… ４ 　 技术要求 １ ………………………………………………………………………………………………… ５ 　 检验方法 １ ………………………………………………………………………………………………… ６ 　 包装 、 运输及贮存 ２ ………………………………………………………………………………………… ７ 　 保质期 ２ …………………………………………………………………………………………………… 附录 Ａ （ 规范性附录 ） 　 限制性凝血酶酶活检测 ３ ………………………………………………………… 附录 Ｂ （ 规范性附录 ） 　 限制性凝血酶纯度检测 ５ ………………………………………………………… 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ 前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国工具酶标准化工作组 （ ＳＡＣ ／ ＳＷＧ１１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 福建华灿制药有限公司 、 华灿南生 （ 厦门 ） 生物技术有限公司 、 福建南生科技有限公司 、 山东大学 、 安琪酵母股份有限公司 、 三明市产品质量检验所 、 福建农林大学 、 复旦大学 、 苏州大学 、 上海百赛生物科技有限公司 、 海狸纳米科技 （ 苏州 ） 有限公司 、 上海博仕生物科技有限公司 。 本标准主要起草人 ： 黄发灿 、 郑登忠 、 詹学雄 、 郭晓 觧 、 陈秀兰 、 赵晶 、 章丽丽 、 庄丽琼 、 黄发喜 、 林乐钞 、 陈劲春 、 姚娟 、 刘斌 、 张熙颖 、 钟江 、 朱力 、 任辉 、 邢志刚 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ 引 　　 言 　　 限制性凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶 ， 能识别 ＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇ ↓ ＧｌｙＳｅｒ 氨基酸序列 ， 是基因工程中重组融合蛋白的酶切工具 。 制定限制性凝血酶国家标准 ， 用以推动该类工具酶的产业化 ， 对于限制性凝血酶的生产和使用具有重要意义 。 Ⅱ 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ 限制性凝血酶 １ 　 范围 本标准规定了限制性凝血酶的技术要求 、 检验方法 、 包装 、 运输 、 贮存和保质期 。 本标准适用于从猪血液中提取的限制性凝血酶 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ１９１ 　 包装储运图示标志 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 　 限制性凝血酶 　 狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀狋犺狉狅犿犫犻狀 一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶 ， 能识别 ＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇ ↓ ＧｌｙＳｅｒ 氨基酸序列 ， 用于酶切具有凝血酶酶切位点的重组融合蛋白 。 ３ ． ２ 　 限制性凝血酶活力单位 　 犪犮狋犻狏犻狋狔狌狀犻狋狅犳狉犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀狋犺狉狅犿犫犻狀 ２０℃ ， ｐＨ８．４ 条件下 ， 在 ５０ μ Ｌ 含有 ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ 、 ０．１５ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ 、 ２．５ｍｍｏｌ ／ ＬＣａＣｌ ２ 的缓冲液里 ， １６ｈ 内酶切水解 １ μ ｍｏｌ 融合蛋白所需的限制性凝血酶量为一个活力单位 （ Ｆａｃａｎｕｎｉｔ ）。 ４ 　 技术要求 ４ ． １ 　 外观 白色或类白色的冻干块状物或粉末 。 ４ ． ２ 　 酶活 ≥ ３５０Ｆａｃａｎｕｎｉｔ ／ ｍｇ 。 ４ ． ３ 　 纯度 ２０ μ ｇ 限制性凝血酶经 ＳＤＳＰＡＧＥ 电泳结果显示为单条带 。 ５ 　 检验方法 ５ ． １ 　 外观 直接或将样品倒入无色透明试管中 ， 在自然光条件下 ， 肉眼观察 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ ５ ． ２ 　 酶活 依据附录 Ａ 的方法进行检测 。 ５ ． ３ 　 纯度 依据附录 Ｂ 的方法进行检测 。 ６ 　 包装 、 运输及贮存 ６ ． １ 　 包装 内包装材料应洁净无污染 ， 封口应严密 ， 无泄漏 。 外包装箱储运图示标志应符合 ＧＢ ／ Ｔ１９１ 的规定 。 ６ ． ２ 　 运输 产品应在冷冻条件下运输 ， 运输工具应清洁卫生 、 干燥 ， 并有防雨 、 防晒设施 ， 运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损 。 不宜与有毒 、 有害 、 有异味物品混运 。 ６ ． ３ 　 贮存 应在温度低于 －２０℃ 的条件下储存 。 ７ 　 保质期 在符合本标准规定的条件下 ， 包装完好未启封的产品保质期为三年 ； 超过保质期 ， 使用前应检测酶活 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ 附 　 录 　 犃 （ 规范性附录 ） 限制性凝血酶酶活检测 犃 ． １ 　 仪器和设备 犃 ． １ ． １ 　 紫外分光光度计 。 犃 ． １ ． ２ 　 恒温培养箱 。 犃 ． １ ． ３ 　 电泳仪 ， 备电泳槽 。 犃 ． ２ 　 试剂 犃 ． ２ ． １ 　 ＧＳＴＴａｑ 融合蛋白 。 犃 ． ２ ． ２ 　 Ｔｒｉｓ 。 犃 ． ２ ． ３ 　 ＨＣｌ 。 犃 ． ２ ． ４ 　 ＮａＣｌ 。 犃 ． ２ ． ５ 　 ＣａＣｌ ２ 。 犃 ． ３ 　 试剂溶液配制 犃 ． ３ ． １ 　 ｃｌｅａｖａｇｅｂｕｆｆｅｒ 配制 ： ２０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ （ ｐＨ８．４ ）， ０．１５ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ２．５ｍｍｏｌ ／ ＬＣａＣｌ ２ 。 犃 ． ３ ． ２ 　 融合蛋白溶液配制 ： 精密称取融合蛋白约 ２５ｍｇ ， 用 ｃｌｅａｖａｇｅｂｕｆｆｅｒ 溶解并定容至 ２５ｍＬ ， 紫外分光光度法检测蛋白浓度后再稀释成每毫升含 ０．１ｍｇ 蛋白的溶液 ， 即得 。 犃 ． ３ ． ３ 　 限制性凝血酶溶液配制 ： 精密称量限制性凝血酶适量 ， 用 ｃｌｅａｖａｇｅｂｕｆｆｅｒ 溶解制成每毫升含 １ｍｇ 蛋白的溶液 ， 再稀释成每 ｍＬ 含 ０．０２ｍｇ 蛋白的溶液 ， 即得 。 犃 ． ３ ． ４ 　 ２ 倍 ＳＤＳ 样品缓冲液配制 ： ４０ｍＬ 纯化水 ， １．５２ｇＴｒｉｓ ， ２０ｍＬ 甘油 ， ２ｇＳＤＳ ， ２ｍＬ β  巯基乙醇 ， １ｍｇ 溴酚蓝 ， 用 １ｍｏｌ ／ Ｌ 盐酸调 ｐＨ 至 ６．８ ， 定容至 １００ｍＬ ， 即得 。 犃 ． ４ 　 试验步骤 犃 ． ４ ． １ 　 酶切反应 取离心管 ８ 支 ， 各加入融合蛋白溶液 ４０ μ Ｌ ， 再依次分别加入限制性凝血酶溶液 ０ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ 、 ３ μ Ｌ 、 ４ μ Ｌ 、 ５ μ Ｌ 、 ６ μ Ｌ 、 ７ μ Ｌ 、 ８ μ Ｌ ， 再依次分别加入 ｃｌｅａｖａｇｅｂｕｆｆｅｒ１０ μ Ｌ 、 ８ μ Ｌ 、 ７ μ Ｌ 、 ６ μ Ｌ 、 ５ μ Ｌ 、 ４ μ Ｌ 、 ３ μ Ｌ 、 ２ μ Ｌ ， 置 ２０℃±０．５℃ 水浴中 ， 反应 １６ｈ 后 ， 各加入 ５０ μ Ｌ 的 ２ 倍 ＳＤＳ 样品缓冲液终止酶切反应 ， 分别取各反应液 ２０ μ Ｌ ， 进行 ＳＤＳＰＡＧＥ 凝胶电泳 。 犃 ． ４ ． ２ 　 电泳 １２％ＳＤＳＰＡＧＥ 凝胶电泳 ， 电压 ９０Ｖ ～ １２０Ｖ ， 当溴酚蓝线到达凝胶板底部时停止电泳 ， 取出凝胶 进行染色 ３０ｍｉｎ ， 并过夜脱色至无底色 。 当融合蛋白电泳条带看不见时 ， 表明此时的限制性凝血酶量恰好能将该融合蛋白样品完全酶切 ， 并 ３ 犌犅 ／ 犜 ３５５４０ — ２０１７ 以此反应体系作为依据计算酶活 。 犃 ． ５ 　 酶活计算 产品的酶活 ， 以每毫克样品含有的限制性凝血酶活力 犛 表示 ， 数值以 Ｆａｃａｎｕｎｉｔ ／ ｍｇ 表示 ， 按式 （ Ａ．１ ） 计算 ： 犛 ＝ 犮 １ × 犞 １ × １０ ６ 犠 × 犮 ２ × 犞 ２ …………………………（ Ａ．１ ） 　　 式中 ： 犮 １ ——— 融合蛋白浓度 ， 单位为毫克每毫升 （ ｍｇ ／ ｍＬ ）； 犞 １ ——— 融合蛋白加入