书 书 书犐犆犛 １３ ． ３００ ； １１ ． １００ 犃 ８０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５５２１ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 　 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D /G24 /G25 /G2E /G2F /G30 犆犺犲犿犻犮犪犾狊 — 犈犿犫狉狔狅狋狅狓犻犮犻狋狔 — 犘狅狊狋犻犿狆犾犪狀狋犪狋犻狅狀犲犿犫狉狔狅犮狌犾狋狌狉犲狋犲狊狋 ２０１７  １２  ２９ /G31 /G32 ２０１８  ０７  ０１ /G33 /G34 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G31 /G32书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２５１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 宁波出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 李海山 、 崔媛 、 韩辉 、 陈会明 、 陈小青 、 程艳 、 艾文超 、 谢文平 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５５２１ — ２０１７ 化学品 　 胚胎毒性植入后大鼠全胚胎培养法 １ 　 范围 本标准规定了植入后大鼠全胚胎培养方法检测化学品胚胎毒性的术语和定义 、 试验原理 、 试验方法 、 终点描述 、 质量控制 、 数据分析和评价 。 本标准适用于应用植入后大鼠全胚胎培养法检测化学品的胚胎毒性 。 本标准也可作为药物 、 消费品 、 农业用化学品 、 食品添加剂和污染物胚胎毒性检测的参考方法 。 ２ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ２ ． １ 　 半数致畸浓度 犐犆 ５０ 　 犳狅狉犿犪犾犳狅狉犿犪狋犻狅狀狊 ＩＣ ５０ ５０％ 的胚胎出现畸形的受试物浓度 。 ２ ． ２ 　 ３ 犜 ３ 细胞半数生长抑制浓度 犐犆 ５０ 　 犳狅狉犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀狅犳狋犺犲犵狉狅狑狋犺狅犳 ３ 犜 ３ 犮犲犾犾狊 ＩＣ ５０ （ ３Ｔ３ ） ５０％ 的 ３Ｔ３ 细胞生长受抑制的受试物浓度 。 ２ ． ３ 　 最大致畸浓度 犐犆 犿犪狓 　 犳狅狉犿犪犾犳狅狉犿犪狋犻狅狀狊 ＩＣ ｍａｘ 最大比率出现畸形的受试物最低浓度 。 ２ ． ４ 　 总体形态学评分无效应浓度 犐犆 犖犗犈犆 　 犳狅狉狋狅狋犪犾犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾狊犮狅狉犲 ＩＣ ＮＯＥＣＴＭＳ 对总体形态学评分未见异常效应的最高浓度 。 ３ 　 试验原理 含有 １ 个 ～ ５ 个体节的大鼠胚胎在 ４８ｈ 培养后 ， 其生长发育和形态分化与体内同龄胚胎相似 ， 且此时期的胚胎处于器官形成期 ， 对外源化学物敏感 。 转瓶培养有利于胚胎培养液与其上方的气体交换 。 由于胚胎发育对于氧气的需要越来越大 ， 气体交换对于培养液的最佳氧饱和度非常重要 。 测试完成后 ， 评估胚胎的形态 ， 将对照组和实验组的胚胎进行比较 ， 得到受试物胚胎毒性结果 。 ４ 　 试验方法 ４ ． １ 　 仪器设备 使用设备和器具如下 ： １ 犌犅 ／ 犜 ３５５２１ — ２０１７ ——— 体视显微镜 ； ——— 镊子 ； ——— 手术剪 ； ——— 移液器 ； ——— 培养皿 ： 直径约 １００ｍｍ ； ——— 带旋转设备的 ３７℃ 培养箱 （ 宜内带观察显微镜 ）； ——— 旋转培养瓶 ： 容量至少 １０ｍＬ 。 ４ ． ２ 　 试剂和材料 ４ ． ２ ． １ 　 大鼠 ４ ． ２ ． １ ． １ 　 用 ０．０３ｍｇ ／ Ｌ 、 ０．１ｍｇ ／ Ｌ 、 ０．３ｍｇ ／ Ｌ 和 １ｍｇ ／ Ｌ 的 ５ 氟尿嘧啶进行阳性对照实验 ， １０００ｍｇ ／ Ｌ 的青霉素 Ｇ 钠进行阴性对照实验 ， 通过了阳性和阴性对照化合物的质量检查 ， 并且有足够胚胎数目的大鼠品系可用于本标准 。 ４ ． ２ ． １ ． ２ 　 大鼠在温度 ２０℃ ～ ２４℃ ， 湿度 ５０％ ～ ７０％ 的 ＳＰＦ 级动物房中饲养 ， 自由进食 ， 不限饮水 。 ４ ． ２ ． １ ． ３ 　 每天检查大鼠的一般行为 ， 保持其健康 。 ７ 周龄 ～ １０ 周龄 、 未经产雌鼠至少适应 ２ 周后 ， 与至少 １０ 周龄的雄鼠交配 。 用于制备血清的雄鼠体重应不低于 ２５０ｇ 。 ４ ． ２ ． ２ 　 化合物和培养液 使用的化合物和培养液如下 ： ——— Ｈａｎｋ ’ ｓ 平衡盐溶液 （ ＨＢＳＳ ）： 含 ０．１８５ｇ ／ Ｌ 的 ＣａＣｌ ２ ， ８．０ｇ ／ Ｌ 的 ＮａＣｌ ， ０．４ｇ ／ Ｌ 的 ＫＣｌ ， ０．２ｇ ／ Ｌ 的 ＭｇＳＯ ４ ， ０．３０８ｇ ／ Ｌ 的 ＮａＨＣＯ ３ ， １．０ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖 ， ０．０７５ｇ ／ Ｌ 的 Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ ， ０．０６０ｇ ／ Ｌ 的 ＫＨ ２ ＰＯ ４ ， ６℃ 保存 ， 以上试剂均为分析纯 ； ——— 二甲基亚砜 （ ＤＭＳＯ ， 分析纯 ）； ——— 乙醇 （ 分析纯 ）； ——— 二氧化碳 （ ＣＯ ２ ， 工业级 ）； ——— ５ 氟尿嘧啶 ； ——— 青霉素 Ｇ 钠 ； ——— 无菌真空采血管 。 ４ ． ２ ． ３ 　 血清制备 雄性大鼠采用 ＣＯ ２ 麻醉后 ， 打开腹腔 ， 找到主动脉 ， 用无菌真空采血管从主动脉收集血液 ， 在 １ｍｉｎ 之内完成 。 １８００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 后吸取血清于冰上保存 。 采集完所有样品后 ， 再次于 １８００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ ， 收集血清 ， 于 ５６℃ 热灭活 ３０ｍｉｎ 。 －２０℃ 储存备用 ， 使用前于 ３７℃ 热融 。 ４ ． ３ 　 测试过程 ４ ． ３ ． １ 　 交配过程 雌性大鼠饲养在 １２ｈ ／ １２ｈ 明暗交替的环境中 ， 上午 ６ 时至下午 ６ 时为暗 。 下午 ４ 时至 ６ 时 ， 将发情的未经产的雌鼠与雄鼠合笼 ， 次日清晨分笼 。 ４ ． ３ ． ２ 　 分离胚胎 妊娠第 １０ 天上午 （ 合笼当天为第 ０ 天 ）， ＣＯ ２ 麻醉致死 ， 腹腔壁切口分离子宫 ， 转移至手术板 。 用无 菌的镊子和剪刀从子宫里分离蜕膜上的胚胎 。 把独立的胚胎转移到含有无菌 ＨＢＳＳ 的培养皿中 ， 在显 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５５２１ — ２０１７ 微镜下用无菌手术镊子小心放入去掉蜕膜组织的赖歇特膜和卵黄囊壁 ， 留下完整的内卵黄囊 。 含有 １ 个 ～ ５ 个体节的胚胎将用于试验 。 ４ ． ３ ． ３ 　 受试物制备 每个胚胎培养中加入 ２ｍＬ 大鼠血清 。 采用合适的溶剂溶解化合物 （ 例如 ＨＢＳＳ 、 ＤＭＳＯ 或乙醇 ）。 在胚胎置入培养瓶之前 ， 向培养血清中加入标准体积的化合物溶液 ， 对照组中加入同体积的溶剂 。 加入溶液的体积已在预试验中证明不会干扰培养瓶中胚胎的发育 。 培养瓶中溶剂的最大浓度是 １％ 水相溶液 （ ＨＢＳＳ ）， ０．１２５％ 的 ＤＭＳＯ ， 以及 ０．２％ 的乙醇 。 培养瓶通气后 ， 将胚胎放入培养瓶中 。 每个母体的胚胎被尽可能均匀的分布在对照组和各个实验组中 ， 并且尽可能保证平均每个浓度组的胚胎的起始体节数一致 。 受试化合物浓度梯度和平行对照的数目相当 ， 并且同时进行测试 。 ４ ． ３ ． ４ 　 培养条件 胚胎在 ３７℃ 条件下 ， 以 ２０ｒ ／ ｍｉｎ ～ ４０ｒ ／ ｍｉｎ 转速不间断旋转 ， 无菌培养 ４８ｈ 。 培养瓶每天两次通氧 ， 每次通氧时间 ３０ｓ ， 而且随着培养时间的增长 ， 通氧气体中的氧气含量不断增加 。 通氧计划表 （ 见表 １ ） 给出了一个示例 ， 不同实验室的最佳通氧条件会有所不同 。 如果 ３７℃ 培养箱中带有观察用的显微镜 ， 可在培养后 ０ｈ — ５ｈ — ２１ｈ — ２８ｈ — ４５ｈ 时 ， 通过判断尾端神经管封闭 、 胚胎弯曲 、 卵黄囊循环和心跳频率 （ 见附录 Ａ ） 来检查胚胎完整性 。 胚胎放入培养瓶的时刻定为 ０ｈ 。 表 １ 　 通氧计划表 培养时间 ／ ｈ 气体浓度 ／ ％ Ｏ ２ ＣＯ ２ Ｎ ２ ０ ５ ５ ９０ ５ １０ ５ ８５ ２１ ２０ ５ ７５ ２８ ２０ ５ ７５ ４５ ４０ ５ ５５ ４ ． ３ ． ５ 　 剂量  效应评估 受试物浓度采用十倍稀释的剂量间隔 ， 每个剂量 ３ 个胚胎 ， 来寻找毒性作用范围 。 然后 ， 采用总体形态学评分 （ ＴＭＳ ） 作为效应参数 ， 在最高无效应浓度 、 ＴＭＳ 比对照减少至少 ５０％ 的浓度 ， 以及两个中间浓度时进行测试 ， 每个浓度 ７ 个胚胎 ， 以区分特异性胚胎毒性和一般的发育迟缓 。 测试浓度间隔因子最小为 ２ 。 任何化合物的最高测试浓度为 １０００ｍｇ ／ Ｌ ， 如果在此浓度下 ７ 个胚胎都没有产生效应 ， 那么不需要进行其他浓度的测试 。 ５ 　 终点描述 ５ ． １ 　 实验终点和终点检测 ５ ． １ ． １ 　 大鼠胚胎形态 ： 按照图 １ 所示观察形态变化 （ 胚胎总体观察 ， 包括体节个数 ， 分化滞后 ， 特定的畸形 ）。 ５ ． １ ．