书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５３３７ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C /G2D 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狔犲犾犾狅狑狊狆犲犮犽犾犲狏犻狉狅犻犱 ２０１７  １２  ２９ /G2E /G2F ２０１８  ０７  ０１ /G30 /G31 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2E /G2F书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 、 中国农业科学院植物保护研究所 。 本标准主要起草人 ： 张永江 、 邓丛良 、 骆卫峰 、 赵晓丽 、 吕玉峰 、 张志想 、 辛言言 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５３３７ — ２０１７ 葡萄黄点类病毒检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了葡萄黄点类病毒的检疫鉴定方法 。 本标准适用于可能带有葡萄黄点类病毒的葡萄繁殖材料的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 葡萄黄点类病毒基本信息 学名 ： 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狔犲犾犾狅狑狊狆犲犮犽犾犲狏犻狉狅犻犱 。 缩写 ： ＧＹＳＶｄ 。 异名 ： 葡萄黄斑类病毒 、 葡萄黄痘类病毒 。 分类地位 ： 马铃薯纺锤块茎类病毒科 （ 犘狅狊狆犻狏犻狉狅犻犱犪犲 ）、 苹果锈果类病毒属 （ 犃狆狊犮犪狏犻狉狅犻犱 ）。 葡萄黄点类病毒的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列 。 主要的方法有 ＲＴＰＣＲ 和核酸分子杂交 。 ５ 　 仪器设备 、 主要用具和主要试剂 ５ ． １ 　 仪器设备 电子天平 （ 感量 ０．００１ｇ ）、 普通天平 （ 感量 ０．１ｇ ）、 高速冷冻离心机 、 小型瞬时离心机 、 普通冰箱 、 超低温冰箱 （ －８０℃ ）、 制冰机 、 涡旋振荡器 、 磁力搅拌器 、 高压灭菌锅 、 ｐＨ 计 、 ＰＣＲ 仪 、 微波炉 、 电泳仪 、 电泳槽 、 凝胶分析成像系统 、 实时荧光 ＰＣＲ 仪 、 杂交炉 、 塑料薄膜封口机 、 紫外交联仪 、 暗箱 、 摇床 、 恒温水浴锅 、 组织破碎仪等 。 ５ ． ２ 　 主要用具 可调移液器 （ ２．５ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ 、 ５０００ μ Ｌ ）、 无 ＲＮＡ 酶吸头 （ １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ 、 ５０００ μ Ｌ ）、 无 ＲＮａｓｅ 离心管 （ １．５ｍＬ 、 ５ｍＬ 、 １０ｍＬ ）、 研钵 、 研棒 、 磁性分离架 、 ＰＣＲ 反应管 （ ２００ μ Ｌ ）、 实时荧光 ９６ 孔反应板 、 杂交瓶 、 杂交膜 、 杂交袋 、 Ｘ 光片 。 ５ ． ３ 　 主要试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中相关规定 。 普通 ＲＴＰＣＲ 检 １ 犌犅 ／ 犜 ３５３３７ — ２０１７ 测试剂见附录 Ｂ ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｃ ； 斑点杂交检测试剂见附录 Ｄ 。 ６ 　 检测与鉴定 ６ ． １ 　 普通 犚犜犘犆犚 检测方法 普通 ＲＴＰＣＲ 检测方法见附录 Ｂ 。 ６ ． ２ 　 实时荧光 犚犜犘犆犚 检测方法 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测方法见附录 Ｃ 。 ６ ． ３ 　 斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录 Ｄ 。 ７ 　 结果判定 样品经普通 ＲＴＰＣＲ 检测为阳性 ， 且实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测为阳性或斑点杂交检测为阳性 ， 则判定为检出葡萄黄点类病毒 。 样品经普通 ＲＴＰＣＲ 检测为阳性 ， 且序列测定结果与已知的 ＧＹＳＶｄ 序列一致 ， 则判定为检出葡萄黄点类病毒 。 样品经实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测为阳性 ， 且序列测定结果与已知的 ＧＹＳＶｄ 序列一致 ， 则判定为检出葡萄黄点类病毒 。 ８ 　 样品保存与结果记录 ８ ． １ 　 样品保存 样品经登记人和经手人签字后妥善保存 ３ 个月 ， 种子保存在 ４℃ 冰箱内 ， 生长苗木或插条保存在隔离温室中培养 ， 叶片 、 果实等样品在 －８０℃ 冰箱内保存 。 对检出葡萄黄点类病毒的样品应至少保存 ６ 个月 ， 以备复核 、 谈判和仲裁 。 保存期满后 ， 应灭活处理 。 ８ ． ２ 　 结果记录 完整的实验记录要包括样品的来源 、 种类 、 采集时间 、 实验检测时间 、 地点 、 方法和结果 ， 并有实验人员的签字 ； 普通 ＲＴＰＣＲ 检测结果保存电泳照片 ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测结果保存荧光曲线图及 Ｃｔ 值 ； 斑点杂交检测保存照片 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５３３７ — ２０１７ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 葡萄黄点类病毒相关资料 犃 ． １ 　 基本信息 葡萄黄点类病毒 （ 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狔犲犾犾狅狑狊狆犲犮犽犾犲狏犻狉狅犻犱 ， ＧＹＳＶｄ ）， 又名葡萄黄斑类病毒和葡萄黄痘类病毒 ， 于 １９７２ 年在澳大利亚首次发现 ， 包括葡萄黄斑类病毒 １ 号 （ 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狔犲犾犾狅狑狊狆犲犮犽犾犲狏犻狉狅犻犱 １ ， ＧＹＳＶｄ１ ） 和葡萄黄斑类病毒 ２ 号 （ 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狔犲犾犾狅狑狊狆犲犮犽犾犲狏犻狉狅犻犱 ２ ， ＧＹＳＶｄ２ ）。 犃 ． ２ 　 寄主范围 自然条件下侵染葡萄 （ 犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪 ）。 犃 ． ３ 　 危害症状 寄主受 ＧＹＳＶｄ 侵染后 ， 多表现隐症 。 有的葡萄叶片产生黄色斑点或形状不规则的黄色斑块 ， 有时出现黄色环斑或斑驳 。 病斑多分布于主脉或侧脉附近 。 与葡萄扇叶病毒复合侵染 ， 产生镶脉症状 。 犃 ． ４ 　 分布地区 澳大利亚 、 美国 、 法国 、 意大利 、 西班牙 、 日本 、 中国等国家 。 犃 ． ５ 　 传播方式 ＧＹＳＶｄ 主要通过嫁接传播和机械传播 ， 也可通过种子传播 。 犃 ． ６ 　 基因组 ＧＹＳＶｄ 为单链环状的 ＲＮＡ 分子 ， 长 ３６３ 个 ～ ３６７ 个核苷酸 ， 能形成类病毒典型的杆状二级结构 。 ＧＹＳＶｄ 与苹果锈果类病毒 （ 犃狆狆犾犲狊犮犪狉狊犽犻狀狏犻狉狅犻犱 ， ＡＳＳＶｄ ） 有 ３７％ 的序列相似性 ， 与马铃薯纺锤块茎类病毒科的其他类病毒也有一定的序列相似性 。 ＧＹＳＶｄ 缺乏该科大多数类病毒具有的中央保守区 ， 但与 ＡＳＳＶｄ 中央保守区序列一致 ， 且都含有稳定的回文结构 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３５３３７ — ２０１７ 附 　 录 　 犅 （ 规范性附录 ） 普通 犚犜犘犆犚 检测方法 犅 ． １ 　 主要试剂 犅 ． １ ． １ 　 １ 犿狅犾 ／ 犔 磷酸氢二钾 （ 犓 ２ 犎犘犗 ４ ） 磷酸氢二钾 　　　　　　　　　　　　　　　 １７．４２ｇ 加双蒸水定容至 １００ｍＬ ， 用 ０．２２ μ ｍ 滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌 。 犅 ． １ ． ２ 　 ２ ． ５ 犿狅犾 ／ 犔 磷酸氢二钾 （ 犓 ２ 犎犘犗 ４ ） 磷酸氢二钾 　　 ４３．５５ｇ 加双蒸水定容至 １００ｍＬ ， 用 ０．２２ μ ｍ 滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌 。 犅 ． １ ． ３ 　 ３ 犿狅犾 ／ 犔 乙酸钠 （ 犖犪犃犮 ）（ 狆犎 ５ ． ２ ） 三水乙酸钠 　　　 ４０．８３ｇ 用 ３ｍｏｌ ／ Ｌ 乙酸调节 ｐＨ 至 ５．２ ， 用双蒸水定容至 １００ｍＬ ， 高压蒸汽灭菌 。 犅 ． １ ． ４ 　 ４ 犿狅犾 ／ 犔 氯化锂 （ 犔犻犆犾 ） 氯化锂 　　　 １６．９６ｇ 加双蒸水定容至 １００ｍＬ 。 用 ０．２２ μ ｍ 滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌 。 贮存于 ４℃ 。 犅 ． １ ． ５ 　 研磨缓冲液 异硫氰酸胍 （ ＧＩＴＣ ） 　　　　　　　　 ４ｍｏｌ ／ Ｌ 十二烷基肌氨酸钠 　　　　　　　　 ５ｇ ／ Ｌ 曲拉通 Ｘ１００ （ ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ） 　　　 ０．１％ （ 体积分数 ） 氯化钠 （ ＮａＣｌ ） 　　　　　　　　　　 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ 柠檬酸钠缓冲液 （ ｐＨ７．０ ） 　　　　　 ２５ｍｍｏｌ ／ Ｌ 聚乙烯吡咯烷酮 （ ＰＶＰ ） 　　　　　　　 ２０ｇ ／ Ｌ 犅 ． １ ． ６ 　 ５０× 犜犃犈 缓冲液 Ｔｒｉｓ 碱 　　　　　　　　　　　　　　　 ２４２ｇ 冰