书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ０１ 犅 １６ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３５３３２ — ２０１７ /G21 /G22 犃 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狏犻狉狌狊犃 ２０１７  １２  ２９ /G2B /G2C ２０１８  ０７  ０１ /G2D /G2E /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2B /G2C书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ２７１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 福建省农业科学院 、 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 张永江 、 谢丽雪 、 李彬 、 魏梅生 、 李桂芬 、 马洁 、 辛言言 、 张晓雷 、 吴兴海 、 朱水芳 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５３３２ — ２０１７ 葡萄 犃 病毒检疫鉴定方法 １ 　 范围 本标准规定了葡萄 Ａ 病毒 （ 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狏犻狉狌狊犃 ） 的检疫鉴定方法 。 本标准适用于可能携带葡萄 Ａ 病毒的葡萄苗木 、 接穗 、 砧木 、 插条等繁殖材料的检疫鉴定 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＳＮ ／ Ｔ１８４０ 　 植物病毒免疫电镜检测方法 ３ 　 葡萄 犃 病毒基本信息 学名 ： 犌狉犪狆犲狏犻狀犲狏犻狉狌狊犃 。 缩写 ： ＧＶＡ 。 异名 ： 葡萄茎痘相关病毒 （ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｓｔｅｍｐｉｔｔｉｎｇａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ ）。 分类地位 ： β 线形病毒科 （ 犅犲狋犪犳犾犲狓犻狏犻狉犻犱犪犲 ）， 葡萄病毒属 （ 犞犻狋犻狏犻狉狌狊 ）。 ＧＶＡ 的其他信息参见附录 Ａ 。 ４ 　 方法原理 ＧＶＡ 的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据 。 根据 ＧＶＡ 与抗体之间的特异性反应 ， 对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ ＤＡＳＥＬＩＳＡ ） 和免疫电镜检测 ； 依据 ＧＶＡ 的基因组特征建立 ＲＴＰＣＲ 、 实时荧光 ＲＴＰＣＲ ； 通过这些方法的有效组合 ， 判断样品是否带有 ＧＶＡ 。 ５ 　 仪器 、 用具及试剂 ５ ． １ 　 仪器 电子天平 （ 感量 ０．００１ｇ ）、 高速冷冻离心机 、 小型瞬时离心机 、 普通冰箱 、 超低温冰箱 （ －８０℃ ）、 制冰机 、 旋涡振荡器 、 磁力搅拌器 、 高压灭菌锅 、 ｐＨ 计 、 超净工作台 、 ＰＣＲ 仪 、 微波炉 、 电泳仪 、 电泳槽 、 凝胶成像分析仪 、 酶标仪 、 透射电子显微镜 。 ５ ． ２ 　 用具 酶联板 、 可调移液器 （ ２．５ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ 、 １００ μ Ｌ 、 ２００ μ Ｌ 、 １０００ μ Ｌ ） 和可调移液器头 、 离心管 、 研钵 、 微型磨杵等 。 ５ ． ３ 　 试剂 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 ， 实验用水应符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中相关规定 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 试剂 １ 犌犅 ／ 犜 ３５３３２ — ２０１７ 见附录 Ｂ ； ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｃ ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测试剂见附录 Ｄ ； 免疫电镜检测试剂见 ＳＮ ／ Ｔ１８４０ 。 ６ 　 样品制备 将葡萄种苗种植于隔离温室中 ， 在生长期间进行严格的症状检查 。 对可疑症状的植株 ， 采基部发育 良好具症状的叶片 １ｇ 单独制样 ， 用于后续检测 ； 无明显症状的 ， 可 ５ 株混合采样用于后续检测 。 ７ 　 检测鉴定 ７ ． １ 　 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 （ 犇犃犛犈犔犐犛犃 ） 把制备的样品上清液加入已包被 ＧＶＡ 抗体的酶联板中 ， 进行 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测 。 每个样品平行加 到两个孔中 。 健康的植物组织作为阴性对照 ， 感染 ＧＶＡ 的植物组织作为阳性对照 ， 样品提取缓冲液作 为空白对照 ； 其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致 。 具体操作见附录 Ｂ 。 ７ ． ２ 　 免疫电镜检测 免疫电镜检测方法见 ＳＮ ／ Ｔ１８４０ 。 ７ ． ３ 　 犚犜犘犆犚 检测 ＲＴＰＣＲ 检测的阴性和阳性对照设置同 ７．１ ， 灭菌双蒸水作为空白对照 。 分别提取样品和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｃ 。 ７ ． ４ 　 实时荧光 犚犜犘犆犚 检测 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测的阴性和阳性对照设置同 ７．１ ， 灭菌双蒸水作为空白对照 。 分别提取样品 和对照的总 ＲＮＡ ， 反转录合成 ｃＤＮＡ 后进行实时荧光 ＰＣＲ 检测 ， 具体操作见附录 Ｄ 。 如采用商品化一 步法试剂盒 ， 则按照试剂盒说明进行 。 ８ 　 结果判定 样品检测时 ， 检测流程及结果判定按下述原则进行 ： 采用 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 或免疫电镜方法进行检测 ， 若 ： ——— 检测结果为阳性时 ： ＲＴＰＣＲ 的检测结果为阳性 ， 则判定样品携带 ＧＶＡ ； 或用实时荧光 ＲＴＰＣＲ 进行检测 ， 若检测结果为阳性 ， 则判定样品携带 ＧＶＡ 。 ——— 检测结果为阴性时 ： ＲＴＰＣＲ 的检测结果为阴性 ， 则判定样品不携带 ＧＶＡ ； 检测结果为阳性 ， 则对产物进行测序 ， 测定的序列为 ＧＶＡ 序列 ， 则判定样品携带 ＧＶＡ ； 或用实时荧光 ＲＴＰＣＲ 进行检测 ， 若检测结果为阴性 ， 则判定样品不携带 ＧＶＡ ； 若检测结果 为阳性 ， 则判定样品携带 ＧＶＡ 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５３３２ — ２０１７ ９ 　 样品保存与结果记录 ９ ． １ 　 样品保存 经检测确定携带 ＧＶＡ 的样品应保存在适合的条件下以备复核 。 活体的病株在隔离温室中保存 ， 其他的离体材料如叶片等样品可保存在 －８０℃ 冰箱中 ； 做好登记和标记工作 ， 保存期限至少 １ 年 。 ９ ． ２ 　 结果记录 记录包括样品来源 、 种类 、 检测时间 、 地点 、 方法和结果 、 检测人员签字 。 ＤＡＳＥＬＩＳＡ 检测应有酶联反应数值 ； 免疫电镜检测应有电镜图片 ； ＲＴＰＣＲ 检测应有电泳图片 ； 实时荧光 ＲＴＰＣＲ 检测应有荧光曲线图 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３５３３２ — ２０１７ 附 　 录 　 犃 （ 资料性附录 ） 葡萄 犃 病毒相关资料 犃 ． １ 　 寄主范围 自然寄主仅限葡萄属植物 （ 犞犻狋犻狊 ｓｐｐ． ）， 实验寄主包括烟草属一些植物 （ 犖犻犮狅狋犻犪狀犪 ｓｐｐ． ）， ＧＶＡ 也门分离物可引起苋色藜 （ 犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犪犿犪狉犪狀狋犻犮狅犾狅狉 ） 和昆诺阿藜 （ 犆 ． 狇狌犻狀狅犪 ） 局部枯斑 ， 并无症感染曼陀罗 （ 犇犪狋狌狉犪狊狋狉犪犿狅狀犻狌犿 ）， 也门和意大利的分离物还可以侵染千日红 （ 犌狅犿狆犺狉犲狀犪犵犾狅犫狅狊犪 ）， 引起局部枯斑 。 犃 ． ２ 　 为害症状 葡萄 Ａ 病毒为葡萄皱木综合症中 Ｋｏｂｅｒ 茎沟病的病原 ， 嫁接后通常引起美洲砧木 Ｋｏｂｅｒ５ＢＢ 的茎部产生纵向的茎沟 ， 病毒可无症感染一些葡萄的品种和砧木 。 本生烟 （ 犖犻犮狅狋犻犪狀犪犫犲狀狋犺犪犿犻犪狀犪 ） 摩擦接种 １０ｄ ～ １２ｄ 后 ， 叶片出现系统明脉和畸形 ， 植株矮缩 。 犃 ． ３ 　 分布地区 阿尔巴尼亚 、 塞浦路斯 、 捷克 、 法国 、 德国 、 希腊 、 意大利 、 马耳他 、 葡萄牙 、 塞尔维亚 、 斯洛伐克 、 斯洛文尼亚 、 瑞士 、 乌克兰 、 阿富汗 、 亚美尼亚 、 伊朗 、 以色列 、 约旦 、 黎巴嫩 、 土耳其 、 也门 、 叙利亚 、 中国 、 阿尔及利亚 、 埃及 、 摩洛哥 、 南非 、 突尼斯 、 加拿大 、 美国 、 智利 、 巴西 、 澳大利亚 、 新西兰 。 犃 ． ４ 　 传播方式 嫁接传播 。 病毒易于通过嫁接的方式在葡萄间传播 ， 是病毒传播的主要途径 。 Ｋｏｂｅｒ５ＢＢ 是嫁接用的指示植物 。 昆虫传播 。 病毒可由拟长尾粉蚧 （ 犘狊犲狌犱狅犮狅犮犮狌狊犾狅狀犵犻狊狆犻狀狌狊 ）、 犘 ． 犪犳犳犻狀犻狊 、 无花果粉蚧 （ 犘犾犪狀狅犮狅犮犮狌狊 犳犻犮狌狊 ）、 橘粉蚧 （ 犘 ． 犮犻狋狉犻 ） 和 犖犲狅狆狌犾狏犻狀犪狉犻犪犻狀狀狌犿犲狉犪犫犻犾犻狊 传播 。 其中拟长尾粉蚧和无花果粉蚧以半持久方式传播 ＧＶＡ ， 蜕皮后则不能传播 。 犃 ． ５ 　 粒体形态 病毒粒体呈弯曲线状 ， 大