书 书 书犐犆犛 ６７ ． １２０ ． １０ 犅 ４０ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 ３５０２４ — ２０１８ 常见畜禽动物成分检测方法液相芯片法 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳犿犪犿犿犪犾狊犪狀犱狆狅狌犾狋狉狔犻狀犵狉犲犱犻犲狀狋狊 — 犛狌狊狆犲狀犱犲犱犫犲犪犱犪狉狉犪狔 ２０１８  ０５  １４ 发布 ２０１８  １２  ０１ 实施 国家市场监督管理总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ４２１ ） 提出并归口 。 本标准起草单位 ： 中国检验检疫科学研究院 、 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局 、 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、 中华人民共和国山东出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 陈颖 、 吴亚君 、 杨艳歌 、 韩建勋 、 刘鸣畅 、 王斌 、 黄文胜 、 曹际娟 、 王娉 、 张舒亚 、 高宏伟 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３５０２４ — ２０１８ 常见畜禽动物成分检测方法液相芯片法 １ 　 范围 本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法 。 本标准适用于肉及加工品 、 乳 、 皮张 、 内脏 、 动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反刍动物成分 ， 和 １３ 种常见肉品或掺杂成分 （ 骆驼 、 马 、 驴 、 牦牛 、 水牛 、 狗 、 猪 、 马鹿 、 羊 、 鸡 、 鸭 、 大鼠 、 小鼠 ） 动物物种成分的定性检测 。 方法的最低检出限为 （ 质量百分比 ）： 水牛 ５％ ， 哺乳 、 反刍 、 狗 、 羊 、 鸡 、 大鼠 、 小鼠为 １％ ， 骆驼 、 牦牛 、 马鹿 、 猪 、 马 、 驴 、 鸭的最低检测限为 ０．１％ 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ１４６９９．１ 　 饲料 　 采样 ＧＢ ／ Ｔ２７４０３ — ２００８ 　 实验室质量控制规范 　 食品分子生物学检测 ＳＮ ／ Ｔ３５６１ 　 国境口岸卫生监督食品采样 、 送样规程 ３ 　 术语和定义 、 缩略语 ３ ． １ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ ． １ 　 液相芯片技术 　 狊狌狊狆犲狀犱犲犱犫犲犪犱犪狉狉犪狔 通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合 ， 通过流式细胞技术对样品中的多种目标成分进行同时检测 。 ３ ． １ ． ２ 　 液相芯片探针 　 狊狌狊狆犲狀犱犲犱犪狉狉犪狔狆狉狅犫犲 固定于微球表面 ， 能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子 。 ３ ． １ ． ３ 　 质控探针 　 狇狌犪犾犻狋狔犮狅狀狋狉狅犾狆狉狅犫犲 用来监控芯片反应是否正常的探针 。 注 ： 本标准使用的是人工合成的一段寡核苷酸探针 （ ｐｏｌｙＴ ２０ ｐｏｌｙＡ ２０ ， ５′ 端氨基标记 ）。 ３ ． １ ． ４ 　 荧光强度中位值 　 犿犲犱犻犪狀犳犾狌狅狉犲狊犲狀犮犲犻狀狋犲狀狊犻狋狔 液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值 ， 即软件自动读取与样品结合的微球数量 ， 并进行背景值校正后得到的数值 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３５０２４ — ２０１８ ３ ． １ ． ５ 　 阈值 　 犮狌狋狅犳犳狏犪犾狌犲 判定阳性信号的最低荧光强度中位值 。 通过实验数据统计分析后得出 ， 要求防止假阳性结果 ， 同时保证灵敏度需求 。 ３ ． ２ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＣＴＡＢ ： 十六烷基三甲基溴化铵 （ ｃｅｔｙｌｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｌｅｉｃａｃｉｄ ） ｄＡＴＰ ： 脱氧腺苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 脱氧胞苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 脱氧鸟苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 脱氧胸苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＥＤＣ ： １ 乙基  （ ３ 二甲基氨基丙基 ） 碳化二亚胺盐酸盐 ［ Ｎ （ ３ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｄｉｐｒｏｐｙｌ ） Ｎ′ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍａｄｅ ］ ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） ＭＥＳ ： ２ 吗啉乙磺酸 ［ ２ （ Ｎｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ） ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ ］ ＳＡＰＥ ： 链霉亲和素  藻红素 （ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｂｉｌｉｎ ） ＳＤＳ ： 十二烷基硫酸钠 （ ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ ） 犜犪狇 ： 水生栖热菌 （ 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌 ） ＴＥ ： 由 Ｔｒｉｓ 和 ＥＤＴＡ 配制而成的缓冲溶液 （ ＴｒｉｓＥＤＴＡｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ ） ＴＭＡＣ ： 四甲基氯化铵 （ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ ） Ｔｒｉｓ ： 三 （ 羟甲基 ） 氨基甲烷 ［ ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ］ ４ 　 方法提要 对样品中的靶基因进行 ＰＣＲ 扩增 ， 通过液相杂交将偶联探针的微球与 ＰＣＲ 扩增产物结合 ， 采用流式细胞技术对目标成分进行检测 。 每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针 ， 特异结合一种目标核酸序列 。 该核酸序列连接荧光标记物 。 单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测 ， 一束激光检测微球的色标编码 ， 另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物 。 检测单一成分时 ， 将该成分 ＰＣＲ 产物与相应微球进行反应 ； 检测多种成分时 ， 可以将各个成分的 ＰＣＲ 产物与微球混合物进行反应 。 检测实验室需达到 ＧＢ ／ Ｔ２７４０３ — ２００８ 的要求 。 ５ 　 检测用引物和探针 质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针 ， 反刍动物通用引物探针 ， 以及 １３ 种特异性引物和探针序列参见附录 Ａ 中表 Ａ．１ 。 ６ 　 试剂 ６ ． １ 　 犜犪狇 ＤＮＡ 聚合酶 。 ６ ． ２ 　 １０×ＰＣＲ 缓冲液 。 ６ ． ３ 　 ｄＮＴＰｓ （ ｄＡＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＴＴＰ ）。 ６ ． ４ 　 琼脂糖 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３５０２４ — ２０１８ ６ ． ５ 　 溴化乙锭 。 ６ ． ６ 　 酚 。 ６ ． ７ 　 三氯甲烷 。 ６ ． ８ 　 异丙醇 。 ６ ． ９ 　 无水乙醇 。 ６ ． １０ 　 异戊醇 。 ６ ． １１ 　 分子量标准品 （ 最小片段 ≥ ２０ｂｐ ， 最大片段 ≤ ２０００ｂｐ ）。 ６ ． １２ 　 ＴＥ 缓冲液 （ １０ｍｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ ， ｐＨ８．０ ， １ｍｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ）。 ６ ． １３ 　 电泳缓冲液 （ １０×ＴＢＥ ： Ｔｒｉｓ５４ｇ ， 硼酸 ２７．５ｇ ， ２０ｍＬ０．５ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ · ＴｒｉｓＨＣｌ ， ｐＨ８．０ ， 加水至 １０００ｍＬ ； ５０×ＴＡＥ ： Ｔｒｉｓ２４２ｇ ， １００ｍＬ０．５ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， ｐＨ８．０ ， 冰乙酸 ， ５７．１ｍＬ ， 加水至 １Ｌ ）。 ６ ． １４ 　 加样缓冲液 （ ０．２５％ 溴酚蓝 ， ４０％ 蔗糖水溶液 ）。 ６ ． １５ 　 非磁性微球 （ 微球直径 ５．６ μ ｍ ， 羧基修饰 ， 按比例掺入 ６６０ｎｍ 和 ７３０ｎｍ 两种分类荧光染色 ， 每种荧光有 １０ 种浓度 ， 根据比例不同可以把球型基质分类为 １００ 种 ）。 ６ ． １６ 　 ０．１ｍｏｌ ／ ＬＭＥＳ 溶液 。 ６ ． １７ 　 ＥＤＣ 溶液 （ １０ｍｇ ／ ｍＬ ）。 ６ ． １８ 　 ０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０ 。 ６ ． １９ 　 ０．１％ＳＤＳ 。 ６ ． ２０ 　 ＳＡＰＥ 溶液 。 ６ ． ２１ 　 ＴＭＡＣ 溶液 （ ５ｍｏｌ ／ ＬＴＭＡＣ ， ２０％Ｎ 月桂酰肌氨酸 ， １ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ ， ｐＨ８．０ ， ０．５ｍｏｌ ／ ＬＥＤＴＡ ， ｐＨ８．０ ）。 ６ ． ２２ 　 ＣＴＡＢ 提取液 （ ２０ｇ ／ ＬＣＴＡＢ ， １．４ｍｏｌ ／ ＬＮａＣｌ ， ０．１ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ ， ０．０２ｍｏｌ ／ ＬＮａ ２ ＥＤＴＡ ， ｐＨ８．０ ）。 ６ ． ２３ 　 除另有规定外 ， 所有试剂均为分析纯 。 实验用水符合 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 中二级水的要求 。 ７ 　 仪器设备 ７ ． １ 　 ＰＣＲ 仪 。 ７ ． ２ 　 液相芯片仪 。 ７ ． ３ 　 恒温箱 。 ７ ． ４ 　 离心机 ： 离心力 １５０００ 犵 。 ７ ． ５ 　 微量移液器 ： ０．５ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ ， １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ ， ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ ， ２００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 。 ７ ． ６ 　 核酸蛋白分析仪 。 ７ ． ７ 　 天平 ： 感量