书 书 书犐犆犛 ０７ ． ０８０ 犃 ２１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３４８００ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 犓 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B /G2C 犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狅犳犪犮狋犻狏犻狋狔犪狀犱犻犿狆狌狉犻狋狔狅犳狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犓 ２０１７  １１  ０１ /G2D /G2E ２０１８  ０５  ０１ /G2F /G30 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2D /G2E书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中国标准化研究院提出并归口 。 本标准起草单位 ： 东营瑞达生物科技有限公司 、 中国标准化研究院 、 中国生物技术发展中心 、 河北农业大学 、 浙江工商大学 、 合肥工业大学 、 河北省出入境检验检疫局 、 泉州市标准化研究所 、 北京市食品科学研究院 、 河北食品检验研究院 、 河南大学 。 本标准主要起草人 ： 方存林 、 马爱进 、 苏月 、 孙纪录 、 王彦波 、 郑磊 、 刘道亮 、 林清山 、 孙勇 、 云振宇 、 傅玲琳 、 赵琳 、 吴琦 、 周魏 、 康文艺 、 陈新凯 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３４８００ — ２０１７ 蛋白酶 犓 酶活力及杂质检测方法 １ 　 范围 本标准规定了蛋白酶 Ｋ 检测原理 、 仪器设备及器具 、 主要试剂 、 分析步骤和结果分析 。 本标准适用于生化试剂蛋白酶 Ｋ 产品的生产和检测 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ ／ Ｔ３４２２２ 　 核糖核酸酶活力检测方法 ＧＢ ／ Ｔ３４８０１ 　 脱氧核糖核酸酶活力检测方法 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 蛋白酶 犓 　 狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犓 能水解天然角蛋白 （ ｋｅｒａｔｉｎ ） 的一种丝氨酸蛋白酶 。 注 ： 按产品形态分为固态和液态 。 ３ ． ２ 蛋白酶 犓 酶活力单位 　 狆狉狅狋犲犻狀犪狊犲犓犪犮狋犻狏犻狋狔狌狀犻狋 在 ５７℃ 和 ｐＨ８．０ 条件下 ， 在 １ｍｉｎ 内水解牛血红蛋白产生 １ μ ｍｏｌ 酚基氨基酸的酶量 。 注 ： 一个酶活力单位以 Ｕ 表示 。 ４ 　 原理 蛋白酶 Ｋ 可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂 。 它在 ５７℃ 和 ｐＨ８．０ 条件下 ， 水解牛血红蛋白底物产生含有酚基的氨基酸 ； 在碱性条件下 ， 可将福林 （ Ｆｏｌｉｎ ） 试剂还原 ， 生成钼蓝与钨蓝 ， 其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比 。 通过在 ６８０ｎｍ 测定其吸光度 ， 得到水解产生的酚基氨基酸的量 ， 进而计算蛋白酶 Ｋ 酶活力 。 ５ 　 仪器设备及器具 ５ ． １ 　 恒温水浴锅 ： 精度为 ±０．１℃ 。 ５ ． ２ 　 ｐＨ 计 ： 精度为 ０．１ｐＨ 单位 。 ５ ． ３ 　 分光光度计 ： 波长范围 ３８０ｎｍ ～ ７８０ｎｍ ， 吸光度值精确至 ０．００１ 。 ５ ． ４ 　 １ｃｍ 比色皿 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３４８００ — ２０１７ ５ ． ５ 　 电子天平 ： 精度为 ０．０００１ｇ 、 ０．０１ｇ 和 ０．１ｇ 。 ５ ． ６ 　 高速离心机 ： 最小离心力为 ８０００ 犵 ， 具 １．５ｍＬ 离心管 。 ６ 　 主要试剂 本方法所用试剂均为分析纯 ， 除特殊说明外 ， 实验用水均为 ＧＢ ／ Ｔ６８８２ 规定的二级水 。 ６ ． １ 　 ０ ． ０１ 犿狅犾 ／ 犔 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液 （ 犜狉犻狊犎犆犾 ）， 狆犎 ８ ． ０ 称取三羟甲基氨基甲烷 （ Ｔｒｉｓ ） １２．１１ｇ ， 加入适量水使其溶解 ， 定容至 １００ｍＬ ， 用浓盐酸调至 ｐＨ８．０ ， 即成 １ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 。 再取 １ｍＬ１ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 ， 加水定容至 １００ｍＬ ， 即成 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液 。 ６ ． ２ 　 ０ ． ４ 犿狅犾 ／ 犔 三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸 ６５．４０ｇ ， 用水溶解并定容至 １０００ｍＬ 。 ６ ． ３ 　 １ 犿狅犾 ／ 犔犎犆犾 溶液 取 ８．５０ｍＬ 浓盐酸加入到 ５０ｍＬ 水中稀释 ， 然后定容至 １００ｍＬ ， 得 １ｍｏｌ ／ ＬＨＣｌ 溶液 。 ６ ． ４ 　 ０ ． １ 犿狅犾 ／ 犔犎犆犾 溶液 取 １０．００ｍＬ１ｍｏｌ ／ ＬＨＣｌ 溶液加水定容至 １００ｍＬ ， 得 ０．１ｍｏｌ ／ ＬＨＣｌ 溶液 。 ６ ． ５ 　 １ ％ 牛血红蛋白溶液 准确称取牛血红蛋白 （ ＢＲ ， 分子质量 ６４．５ｋＤ ） １．０００ｇ ， 用 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ８．０ 的 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液溶解 ， 并定容至 １００ｍＬ 。 此溶液在 ４℃ 冰箱贮存 ， 有效期为 ３ 天 。 ６ ． ６ 　 ０ ． ４ 犿狅犾 ／ 犔 碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠 ４２．４０ｇ ， 用水溶解并定容至 １０００ｍＬ 。 ６ ． ７ 　 福林 （ 犉狅犾犻狀 ） 试剂 于 ２０００ｍＬ 磨口回流装置加入钨酸钠 （ Ｎａ ２ ＷＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ） １００．０ｇ 、 钼酸钠 （ Ｎａ ２ ＭｏＯ ４ · ２Ｈ ２ Ｏ ） ２５．０ｇ 、 水 ７００ｍＬ 、 ８５％ 磷酸 ５０ｍＬ 、 浓盐酸 １００ｍＬ 。 小火沸腾回流 １０ｈ 。 取下回流冷却器 ， 在通风橱中加入硫酸锂 （ Ｌｉ ２ ＳＯ ４ ） ５０ｇ 、 水 ５０ｍＬ 和数滴浓溴水 。 再微沸 １５ｍｉｎ ， 以除去多余的溴 ， 至冷却后无绿色 。 加水定容至 １０００ｍＬ 。 混匀 ， 过滤 。 试剂应呈金黄色 。 贮存于棕色瓶内 ， 避光保存 。 使用时 ， 用 １ 份福林试剂与 ２ 份水混匀 ， 制成稀福林试剂 。 也可将商品化福林试剂按照产品使用指南稀释成稀福林试剂 。 ６ ． ８ 　 １００ μ 犵 ／ 犿犔犔 酪氨酸标准溶液 称取纯度 ≥ ９５％ 的 Ｌ 酪氨酸 ０．１０００ｇ ， １０５℃ 干燥至恒重 ， 用 ２０ｍＬ１ｍｏｌ ／ ＬＨＣｌ 溶液溶解后 ， 再用水定容至 １００ｍＬ ， 即为 １ｍｇ ／ ｍＬＬ 酪氨酸标准储备溶液 ， 在 ４℃ 冰箱贮存 。 临用前 ， 吸取 １ｍｇ ／ ｍＬＬ 酪氨酸标准储备溶液 １０．００ｍＬ ， 用 ０．１ｍｏｌ ／ Ｌ 盐酸溶液定容至 １００ｍＬ ， 即得到 １００ μ ｇ ／ ｍＬ 的 Ｌ 酪氨酸标准溶液 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 核糖核酸酶 （ 犚犖犪狊犲 ） 酶活力 按 ＧＢ ／ Ｔ３４２２２ 进行检测 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３４８００ — ２０１７ ７ ． ２ 　 脱氧核糖核酸酶 （ 犇犖犪狊犲 ） 酶活力 按 ＧＢ ／ Ｔ３４８０１ 进行检测 。 ７ ． ３ 　 蛋白酶 犓 酶活力 ７ ． ３ ． １ 　 标准曲线绘制 按表 １ ， 在 １０ｍＬ 容量瓶中配制 Ｌ 酪氨酸标准工作溶液 。 表 １ 　 犔 酪氨酸标准工作溶液配制 管号酪氨酸标准工作溶液 的浓度 ／（ μ ｇ ／ ｍＬ ） １００ μ ｇ ／ ｍＬ 酪氨酸 标准溶液 ／ ｍＬ 水 ／ ｍＬ ０ ０．０ ０．００ １０．００ １ １０．０ １．００ ９．００ ２ ２０．０ ２．００ ８．００ ３ ３０．０ ３．００ ７．００ ４ ４０．０ ４．００ ６．００ ５ ５０．０ ５．００ ５．００ ６ ６０．０ ６．００ ４．００ 　　 分别吸取 Ｌ 酪氨酸标准工作溶液 １．０ｍＬ 于具塞试管中 ， 每个浓度作 ２ 个平行 ， 然后加入 ５．０ｍＬ 碳酸钠溶液和 １．０ｍＬ 稀福林试剂 ， 混匀 。 将标准管同时置于 ４０℃ 水浴 ， 反应 ２０ｍｉｎ ， 取出 ， 用冷水迅速冷却至室温 ， 用分光光度计 ， 在 ６８０ｎｍ 波长下 ， 以不含酪氨酸的 ０ 号管为空白 ， 用 １ｃｍ 比色皿 ， 测定吸光度 （ 犃 ）。 以吸光度 犃 为纵坐标 ， 以 Ｌ 酪氨酸的浓度 犆 为横坐标 ， 绘制标准曲线 ， 此线应通过零点 。 得出线性回归方程和回归系数 （ 犚 ２ ）。 回归系数在 ０．９９９０ 及以上时 ， 方可使用 ， 否则应重做 。 新配制的福林试剂应制作新的标准曲线 。 ７ ． ３ ． ２ 　 固体待测样品制备 称取 ０．００５０ｇ 固体酶 ， 精确至 ０．０００１ｇ ， 用 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ８．０ 的 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液溶解 ， 并稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范围内 。 ７ ． ３ ． ３ 　 液体待测样品制备 吸取 １００ μ Ｌ 液体酶 ， 用 ０．０１ｍｏｌ ／ ＬｐＨ８．０ 的 ＴｒｉｓＨＣｌ 缓冲液稀释至酶浓度曲线中呈线性关系的酶浓度范