ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国国家标准 GB/T34750—2025 代替GB/T34750—2017 格拉瑟病诊断技术 DiagnostictechniquesforGlässer’sdisease 2025-01-24发布 2025-08-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 缩略语 1 …………………………………………………………………………………………………… 5 临床诊断 1 ………………………………………………………………………………………………… 6 样品采集、处理及保存 2 …………………………………………………………………………………… 7 细菌分离与鉴定 3 ………………………………………………………………………………………… 8 巢式PCR检测 5 …………………………………………………………………………………………… 9 实时荧光PCR检测 7 ……………………………………………………………………………………… 10 间接ELISA 8 …………………………………………………………………………………………… 11 综合判定 9 ………………………………………………………………………………………………… 附录A(规范性) 分离培养和生化鉴定试剂的配制 11 …………………………………………………… 附录B(资料性) 副猪格拉瑟菌分离鉴定图 12 …………………………………………………………… 附录C(规范性) 巢式PCR和实时荧光PCR所用引物序列 13 ………………………………………… 附录D(资料性) 巢式PCR产物电泳图及荧光PCR扩增曲线图 14 …………………………………… 附录E(资料性) 副猪格拉瑟菌重组P2蛋白的制备及鉴定 15 ………………………………………… 附录F(资料性) 抗体阳性对照(阳性血清)、阴性对照(阴性血清)的制备及鉴定 16 ………………… 附录G(规范性) 间接ELISA检测溶液配制 17 ………………………………………………………… ⅠGB/T34750—2025 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T34750—2017《副猪嗜血杆菌检测方法》,与GB/T34750—2017相比,除结构调 整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了范围(见第1章,2017年版的第1章); ———增加了临床诊断(见第5章); ———更改了样品采集、处理及保存(见第6章,2017年版的6.1); ———更改了细菌分离与鉴定的结果判定(见7.8,2017年版的6.6.7); ———更改了样品DNA的制备(见8.3,2017年版的7.2); ———增加了间接ELISA(见第10章); ———增加了综合判定(见第11章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本文件起草单位:河南省动物疫病预防控制中心、河南省畜产品质量监测检验中心、中国动物卫生 与流行病学中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所。 本文件主要起草人:闫若潜、班付国、谢彩华、吴志明、苏红、程果、马震原、王淑娟、赵明军、徐引弟、 郭育培、杨海波、王翠、刘影、赵雪丽、方先珍、房大学、宋丹、赵美雪、柴茂、刘敏、张利平、刘礼杰、李蛟、 赵胜杰、冉晓龙。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2017年首次发布为GB/T34750—2017。 ———本次为第一次修订。 ⅢGB/T34750—2025 格拉瑟病诊断技术 1 范围 本文件描述了格拉瑟病的临床诊断、样品采集处理与保存、细菌分离与鉴定、巢式PCR检测、实时 荧光PCR检测、间接ELISA等实验室诊断方法。 本文件适用于格拉瑟病的诊断、监测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) Ct值:循环阈值(cyclethreshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay) IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinGs) MGB:小沟结合(minorgroovebinder) NAD:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase) TSA:胰蛋白胨大豆琼脂(trypticsoyagar) TSB:胰蛋白胨大豆肉汤(trypticsoybroth) 5 临床诊断 5.1 流行病学 格拉瑟病是由副猪格拉瑟菌感染引起的细菌性传染病,副猪格拉瑟菌只感染猪,病猪、带菌猪是本 病的主要传染源。不同年龄、性别和品种的猪均易感,主要发生于断奶前后和保育阶段的猪。本病一年 四季均可发生,尤其以早春和深秋季节多发。主要通过呼吸道感染,可分为急性感染和慢性感染,以慢 性感染为主。 1GB/T34750—2025 5.2 临床症状 5.2.1 急性病例 5.2.1.1 发热,体温升高到40.5℃~42℃,精神沉郁,食欲减退。 5.2.1.2 呼吸困难,鼻孔有黏液性及浆液性分泌物。 5.2.1.3 感染初期皮肤发红,后期耳廓边缘发绀。 5.2.1.4 跛行,颤抖,神经症状。 5.2.2 慢性病例 5.2.2.1 食欲下降,消瘦虚弱,被毛粗乱,生长不良。 5.2.2.2 反复发热,咳嗽,呼吸困难。 5.2.2.3 关节肿大,四肢无力或跛行。 5.3 病理变化 5.3.1 心包膜、胸膜、腹膜、关节滑膜以浆液性、纤维素性渗出为炎症特征。 5.3.2 关节肿大,关节内有浆液性、纤维性渗出物或胶冻样物。 5.3.3 胸腔内有大量的淡黄色或略带红色液体及纤维素性渗出物凝块。 5.3.4 心包积液,心包膜增厚,心包内常有干酪样渗出物,与心脏粘连在一起,形成“绒毛心”;心肌有出 血点,表面有大量纤维素渗出。 5.3.5 肺脏淤血、水肿,表面覆盖有纤维蛋白膜,与胸壁粘连。 5.3.6 浆液性或纤维素性腹膜炎,腹腔积液或内脏器官粘连。 5.3.7 全身淋巴结肿大,肝、脾、肾充血与局灶性出血。 5.4 结果判定 符合5.1,且符合5.2中3条以上(含3条),或/和符合5.3病理变化指标一条以上,判定为格拉瑟病 疑似病例,确诊需要实验室诊断。 6 样品采集、处理及保存 6.1 样品的采集及处理 6.1.1 镜检样品 无菌采集疑似副猪格拉瑟菌感染病死猪的肺脏、心脏、脑等新鲜组织,胸腔、腹腔、心包积液或关节 液,抗凝血等样品。 6.1.2 血清样品 自耳静脉或前腔静脉无菌采血,每头应不少于5mL,无菌分离血清,装入2mL离心管中,编号,用 于ELISA检测。 6.1.3 组织样品 采取有明显病变的肺脏、心脏、脑等新鲜组织样品。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于 组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,加入0.3mL~0.5mLPBS混匀,将组织悬液转入无菌离心管 中,编号备用。 2GB/T34750—2025