书 书 书犐犆犛 ６５ ． １５０ 犅 ５０ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３４７４８ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 犇犖犃 /G2A /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F 犌犲狀犲狋犻犮犱犻狏犲狉狊犻狋狔犪狀犪犾狔狊犻狊狅狀犪狇狌犪狋犻犮犵犲狉犿狆犾犪狊犿犫狔犵犲狀狅犿犻犮犇犖犃犿犻犮狉狅狊犪狋犲犾犾犻狋犲犿犪狉犽犲狉狊 ２０１７  １１  ０１ /G30 /G31 ２０１８  ０５  ０１ /G32 /G33 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G30 /G31书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１５６ ／ ＳＣ１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 。 本标准主要起草人 ： 匡友谊 、 孙效文 、 郑先虎 、 梁利群 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３４７４８ — ２０１７ 水产种质资源基因组 犇犖犃 的微卫星分析 １ 　 范围 本标准规定了水产种质资源基因组 ＤＮＡ 的微卫星分析的试剂与材料 、 仪器与设备 、 分析步骤及数据分析 。 本标准适用于水产种质资源基因组 ＤＮＡ 的微卫星分析 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 　 养殖鱼类种质检验 　 第 １５ 部分 ： ＲＡＰＤ 分析 ３ 　 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 ３ ． １ 　 微卫星 　 犿犻犮狉狅狊犪狋犲犾犾犻狋犲 真核生物基因组中由两个或多个核苷酸重复排列形成的短串联重复序列 。 ３ ． ２ 　 微卫星分析 　 犿犻犮狉狅狊犪狋犲犾犾犻狋犲犪狀犪犾狔狊犻狊 用微卫星标记引物对基因组 ＤＮＡ 进行扩增 ， 扩增产物经凝胶电泳检测后 ， 分析电泳图谱并计算其中蕴涵的遗传多态性信息 。 ４ 　 试剂与材料 除 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 规定的试剂与材料外 ， 以下试剂和材料是本标准所需的 。 除非另有说明 ， 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和双蒸馏水或去离子水或相当纯度的水 。 ４ ． １ 　 去离子超纯水 ： 须高压灭菌 。 ４ ． ２ 　 ＴＥＭＥＤ ： 于 ４℃ 冰箱中保存 。 ４ ． ３ 　 微卫星标记引物 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 ４ ． ４ 　 丙烯酰胺 ： ＤＮＡ 测序级 。 ４ ． ５ 　 甲叉双丙烯酰胺 ： ＤＮＡ 测序级 。 ４ ． ６ 　 尿素 。 ４ ． ７ 　 去离子甲酰胺 。 ４ ． ８ 　 聚丙烯酰胺凝胶存储液 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 ４ ． ９ 　 １０％ （ 质量体积比 ） 过硫酸铵 （ ＡＰＳ ） 溶液 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 ４ ． １０ 　 聚丙烯酰胺凝胶固定液 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 ４ ． １１ 　 聚丙烯酰胺凝胶染色液 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３４７４８ — ２０１７ ４ ． １２ 　 聚丙烯酰胺凝胶显色液 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 ４ ． １３ 　 电泳载样液 ： 配制方法符合附录 Ａ 。 ４ ． １４ 　 基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 ： 从生物试剂供应商处购买 。 ４ ． １５ 　 １×ＴｒｉｓＥＤＴＡ （ ＴＥ ）： 配制方法符合附录 Ａ 。 ５ 　 仪器与设备 除 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 规定的仪器与设备外 ， 以下仪器与设备是本标准所需的 。 ５ ． １ 　 扫描仪或光密度扫描成像仪 。 ５ ． ２ 　 垂直电泳槽 １ 套 。 ５ ． ３ 　 ＤＮＡ 测序电泳槽 １ 套 。 ５ ． ４ 　 高压恒功率电泳仪 １ 套 。 ５ ． ５ 　 自动测序仪或遗传分析仪 。 ５ ． ６ 　 水平转动脱色摇床 。 ６ 　 抽样 试验生物抽样按照 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 的规定执行 ， 样本量宜 ４０ 个以上 。 ７ 　 分析步骤 ７ ． １ 　 基因组 犇犖犃 提取 可用基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒或已被验证可以抽提到高质量基因组 ＤＮＡ 的方法或按 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 的规定提取基因组 ＤＮＡ 。 若用基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取基因组 ＤＮＡ 按说明书操作 。 ７ ． ２ 　 基因组 犇犖犃 纯度及浓度测定 按 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 的规定执行 。 ７ ． ３ 　 微卫星标记的选择 从受检测物种或近缘种中筛选出扩增稳定 、 重复性好且具有多态性的微卫星标记用于基因组 ＤＮＡ 的微卫星分析 。 微卫星标记应遵循哈代温博格平衡 ， 微卫星标记所含等位基因数宜在 ４ 个以上 ， 微卫星标记数量应遵循标记数量增加而有效等位基因 、 期望杂合度 、 多态性信息含量等不发生显著变化时最少标记的数量 ， 一般为 ２５ 个 ～ ３０ 个 。 ７ ． ４ 　 基因组 犇犖犃 的 犘犆犚 扩增 ７ ． ４ ． １ 　 基因组 犇犖犃 的准备 根据 ７．２ 基因组 ＤＮＡ 纯度和浓度测定结果 ， 取部分 ＤＮＡ 用灭菌的超纯水稀释至 ５０ｎｇ ／ μ Ｌ ， 于 ４℃ 中保存备用 ， 其余放 －２０℃ 冰箱中保存 。 ７ ． ４ ． ２ 　 微卫星标记引物的准备 根据 ７．３ 的原则选择微卫星标记 ， 将合成的引物配制成 １００ μ ｍｏｌ ／ μ Ｌ 的保存液 ， 于 －２０℃ 冰箱中保存备用 。 使用时取部分保存液 ， 配制成 １０ μ ｍｏｌ ／ μ Ｌ 使用液 ， 也可按所需倍数稀释后使用 ， 保存液仍 ２ 犌犅 ／ 犜 ３４７４８ — ２０１７ 放回 －２０℃ 冰箱中保存 。 ７ ． ４ ． ３ 　 犘犆犚 体系 按照 ＧＢ ／ Ｔ１８６５４．１５ 的规定执行 。 ７ ． ４ ． ４ 　 犘犆犚 程序 按下列程序进行扩增 ： 第一个程序 ９４℃ 预变性 ３ｍｉｎ ～ １０ｍｉｎ 后 ， 第二个程序 ９４℃３０ｓ ， 退火 ３０ｓ （ 根据不同引物的退火温度设定 ）， ７２℃３０ｓ ， ２０ 个 ～ ３８ 个循环 ， 第三个程序 ７２℃ 延伸 ５ｍｉｎ ～ １０ｍｉｎ 。 可根据具体反应调节 ＰＣＲ 程序 ， 使扩增效果达到最优 。 扩增产物直接电泳或于 ４℃ 暂时保存 （ 一般不超过 ６ｈ ） 至电泳 。 如需长时间保存 ， 可在 －２０℃ 冰箱中保存 。 ７ ． ５ 　 犘犆犚 产物凝胶电泳检测 ７ ． ５ ． １ 　 电泳检测方法 使用非变性聚丙烯酰胺凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶进行 ＰＣＲ 产物凝胶电泳检测 ， 或用自动测序仪或遗传分析仪进行 ＰＣＲ 产物检测 。 ７ ． ５ ． ２ 　 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 ７ ． ５ ． ２ ． １ 　 非变性聚丙烯酰胺凝胶制备 将胶模玻璃板清洗干净 ， 自然晾干后根据电泳槽设备说明书安装胶模 。 根据检测 ＰＣＲ 产物大小的范围 ， 选择合适的非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度 ， 一般使用 ６％ ～ １２％ 浓度的凝胶 。 量取适量聚丙烯酰胺凝胶存储液 ， 加入 ＴＢＥ 缓冲液 ， 用去离子水定容至所需体积 ， 使 ＴＢＥ 缓冲液终浓度为 １× 。 每毫升加入 ７ μ Ｌ１０％ＡＰＳ 溶液和 １ μ ＬＴＥＭＥＤ ， 搅拌均匀后 ， 迅速灌胶 ， 插入梳子 ， 在灌胶及插入梳子时注意不要产生气泡 。 于室温放置 ３０ｍｉｎ ～ ６０ｍｉｎ ， 待凝胶完全凝固后进行预电泳 。 ７ ． ５ ． ２ ． ２ 　 电泳样品的准备 取 ＰＣＲ 产物 １０ μ Ｌ ， 加入 ２ μ Ｌ ～ ５ μ Ｌ 电泳载样液 ， 混匀 ， 放于 ４℃ 备用 ， 其余的 ＰＣＲ 产物放于 －２０℃ 中保存 ， 以备复查 。 ７ ． ５ ． ２ ． ３ 　 电泳 将凝固好的非变性聚丙烯酰胺凝胶装入垂直电泳槽中 ， 倒入 １×ＴＢＥ 电泳缓冲液 ， 清洗加样孔 ， ２２０Ｖ 恒压 ４℃ ～ １０℃ 下预电泳 ３０ｍｉｎ 。 之后关闭电泳仪电源 ， 取 １ μ Ｌ ～ ８ μ Ｌ 电泳样品上样到凝胶的样品孔中 ， 样品孔的两边和凝胶中间各加一个 ＤＮＡＭＡＲＫＥＲ 作为计算分子量的标准样 ， 在 １Ｖ ／ ｃｍ ～ ８Ｖ ／ ｃｍ 恒压 ４℃ ～ １０℃ 下电泳 。 在电泳载样液中的指示剂到达合适的位置时 ， 关闭电泳仪 。 ７ ． ５ ． ２ ． ４ 　 染色 聚丙烯酰胺凝胶一般采用银染 ， 在染色的各步骤操作中 ， 凝胶均应置于水平转动摇床上使之缓慢摇动 。 固定 ： 将凝胶从玻璃板的胶模中取出 ， 用蒸馏水冲洗 ２ 次 ～ ３ 次 ， 放入盛有固定液的盘中浸泡 １０ｍｉｎ ～ ３０ｍｉｎ 。 ３ 犌犅 ／ 犜 ３４７４８ — ２０１７ 染色 ： 倒掉固定液 ， 用去离子水冲洗凝胶 ３ 次 ， 每次 ５