书 书 书犐犆犛 １１ ． ２２０ 犅 ４１ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ／ 犜 ３４７４６ — ２０１７ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G29 /G2A /G2B 犌犲狀狅狋狔狆犻狀犵犿犲狋犺狅犱狅犳犮犪狀犻狀犲狆犪狉狏狅狏犻狉狌狊 ２０１７  １１  ０１ /G2C /G2D ２０１８  ０５  ０１ /G2E /G2F /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G2F /G31 /G32 /G33 /G21 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G2C /G2D书 书 书前 　　 言 　　 本标准按照 ＧＢ ／ Ｔ１．１ — ２００９ 给出的规则起草 。 本标准由中华人民共和国农业部提出 。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会 （ ＳＡＣ ／ ＴＣ１８１ ） 归口 。 本标准起草单位 ： 扬州大学 、 江苏农牧科技职业学院 、 中国动物卫生与流行病学中心 、 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ： 刘文博 、 张小荣 、 王海燕 、 徐向明 、 邵卫星 、 王涛 、 刘静 、 詹爱军 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 ３４７４６ — ２０１７ 犬细小病毒基因分型方法 １ 　 范围 本标准规定了犬细小病毒 （ 犮犪狀犻狀犲狆犪狉狏狅狏犻狉狌狊 ， 犆犘犞 ） 基因分型方法要求 。 本标准适用于犬细小病毒的病原分型 、 犬细小病毒感染疫情监测和流行病学调查 。 ２ 　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件 ， 其最新版本 （ 包括所有的修改单 ） 适用于本文件 。 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 　 分析实验室用水规格和试验方法 ３ 　 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ＣＰＶ ： 犬细小病毒 （ ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ） ＰＣＲ ： 聚合酶链式反应 （ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ） ＤＮＡ ： 脱氧核糖核酸 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＲＮＡ ： 核糖核酸 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ） ＰＢＳ ： 磷酸盐缓冲液 （ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｂｕｆｆｅｒ ） ＥＤＴＡ ： 乙二胺四乙酸 （ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ ） 犜犪狇 酶 ： 犜犪狇 脱氧核糖核酸聚合酶 （ 犜犪狇 ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ） Ｔｒｉｓ ： 三羟甲基氨基甲烷 ［ ｔｒｉｓ （ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ］ ｄＮＴＰｓ ： 脱氧核糖核苷三磷酸混合物 （ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｍｉｘｔｕｒｅ ） ｄＡＴＰ ： 脱氧腺苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＧＴＰ ： 脱氧鸟苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＣＴＰ ： 脱氧胞苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ｄＴＴＰ ： 脱氧胸苷三磷酸 （ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ） ＲＮａｓｅ ： 核糖核酸酶 （ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ） ４ 　 仪器 ４ ． １ 　 ＰＣＲ 扩增仪 。 ４ ． ２ 　 高速台式冷冻离心机 ： 可控温至 ４℃ 、 离心速度可达 １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 以上 。 ４ ． ３ 　 组织研磨器或者研钵 。 ４ ． ４ 　 ２℃ ～ ８℃ 及 －２０℃ 冰箱和 －７０℃ 以下超低温冰箱 。 ４ ． ５ 　 核酸电泳仪和水平电泳装置 。 ４ ． ６ 　 微量移液器 　 量程分别 ０．２ μ Ｌ ～ ２ μ Ｌ 、 １ μ Ｌ ～ １０ μ Ｌ 、 １０ μ Ｌ ～ １００ μ Ｌ 、 ２０ μ Ｌ ～ ２００ μ Ｌ 和 １００ μ Ｌ ～ １０００ μ Ｌ 的移液器 ， 并配备与移液器相匹配的吸头 。 １ 犌犅 ／ 犜 ３４７４６ — ２０１７ ４ ． ７ 　 高压灭菌锅 。 ４ ． ８ 　 凝胶成像系统 （ 或紫外透射仪 ）。 ５ 　 耗材 ５ ． １ 　 １．５ｍＬ 无 ＤＮＡ 酶离心管 。 ５ ． ２ 　 ０．２ｍＬＰＣＲ 管 。 ６ 　 试剂 除非另有规定 ， 仅使用分析纯试剂 。 ６ ． １ 　 水 ， ＧＢ ／ Ｔ６６８２ ， 三级水 。 ６ ． ２ 　 氯仿 ： 常温保存 。 ６ ． ３ 　 异丙醇 ： 使用前预冷至 －２０℃ 。 ６ ． ４ 　 无水乙醇 ： －２０℃ 预冷 。 ６ ． ５ 　 ７５％ 乙醇 ： 无水乙醇和双蒸水配制 ， －２０℃ 预冷 。 ６ ． ６ 　 犜犪狇 酶及 １０ 倍 犜犪狇 酶反应缓冲液 ： －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融 。 ６ ． ７ 　 ｄＮＴＰｓ ： 含 ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＴＴＰ 各 １０ｍｍｏｌ ／ Ｌ ， －２０℃ 保存 ， 避免反复冻融 。 ６ ． ８ 　 ＤＮＡ 分子量标准 ： ２００ｂｐＤＮＡ 分子量标准 。 ６ ． ９ 　 磷酸盐缓冲液 （ ＰＢＳ ）： 配制见 Ａ．１ 。 ６ ． １０ 　 电泳缓冲液 （ ＴＢＥ ）： 配方及配制方法见 Ａ．２ 。 ６ ． １１ 　 电泳上样缓冲液 ： 配方及配制见 Ａ．３ 。 ６ ． １２ 　 １％ 琼脂糖凝胶板 ： 配制见 Ａ．４ 。 ６ ． １３ 　 引物 ： Ｐａｂｓ 和 Ｐａｂａｓ 用于第一轮扩增 ， Ｐｂｓ 和 Ｐｂａｓ 用于第二轮扩增 ， 其中 ｓ 表示正义链 ， ａｓ 代 表反义链 （ 见附录 Ｂ ）。 引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为 ５０ｐｍｏｌ ／ Ｌ （ 见附录 Ｂ ）。 ６ ． １４ 　 阳性对照模板为经测序验证过犬细小病毒的基因组或 ＶＰ２ 阳性质粒 （ 参见 Ｃ．１ ）， 阴性对照见 （ 参 见 Ｃ．２ ） 或使用空白对照 （ 参见 Ｃ．３ ）。 ７ 　 样品的采集和前处理 ７ ． １ 　 工具 棉拭子 、 一次性无菌注射器 、 剪刀 、 镊子 、 研钵 、 １．５ｍＬ 离心管 、 移液器吸头 、 药匙 。 所有上述取样工 具 （ 一次性无菌注射器除外 ） 应经 １２１℃ ， １５ｍｉｎ 高压灭菌并烘干 ； １．５ｍＬ 离心管 、 吸头应无 ＤＮＡ 酶 污染 。 ７ ． ２ 　 采样方法 ７ ． ２ ． １ 　 采样过程中样本避免交叉污染 ， 采样及样品前处理过程中戴一次性手套 、 口罩 、 帽子 。 ７ ． ２ ． ２ 　 拭子样品 　 鼻拭子采样 ， 采样时要将灭菌处理过的拭子深入鼻腔来回刮 ３ 次 ～ ５ 次 ， 取鼻腔分泌 液 。 取肛门拭子 ， 将灭菌处理过的拭子深入肛门转一圈蘸取粪便 。 粪便采样 ， 用高压过的药匙取新鲜的 粪便 ， 往往为稀便或血便 。 ７ ． ２ ． ３ 　 组织样品 　 组织样品采集时应采取有明显病变组织 ， 编号备用 。 ２ 犌犅 ／ 犜 ３４７４６ — ２０１７ ７ ． ３ 　 存放与运送 采集或处理的样品在 ２℃ ～ ８℃ 条件下保存应不超过 ２４ｈ ； 若需长期保存 ， 放置 －７０℃ 冰箱 ， 但应避免反复冻融 。 采集的样品密封后 ， 采用样品箱加冰密封 ， 尽快运送到实验室 。 ７ ． ４ 　 样品处理 ７ ． ４ ． １ 　 组织样品的处理 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 ０．５ｇ 左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨 ， 再加 １．０ｍＬＰＢＳ 混匀 ， 然后将组织悬液转入无菌 １．５ｍＬ 离心管中 ， ４℃５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清转入新的无菌 １．５ｍＬ 离心管中 ， 取 ５００ μ Ｌ 上清 ， 编号备用 。 ７ ． ４ ． ２ 　 粪便样品的处理 将鼻拭子和肛门拭子一起放入盛有 １．０ｍＬ 拭子悬液的 １．５ｍＬ 离心管中 ， 然后将拭子悬液转入无菌 １．５ｍＬ 离心管中 ， ４℃５０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 取上清转入新的无菌 １．５ｍＬ 离心管管中 ， 取 ５００ μ Ｌ 上清 ， 编号备用 。 ８ 　 犇犖犃 的提取方法 ８ ． １ 　 向 ７．４ 中制备的 ＤＮＡ 模板中加入 ８ μ Ｌ 蛋白酶 Ｋ 溶液 （ １００ μ ｇ ／ ｍＬ ） 和 ９２ μ Ｌ１０％ 的十二烷基磺酸钠溶液 ， 混匀 。 ５５℃ 孵育 ３０ｍｉｎ 。 ８ ． ２ 　 在样品中加入 ６００ μ Ｌ 酚  氯仿 （ 体积比 １∶１ ）， 上下颠倒混匀 ， ４℃１２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 ８ ． ３ 　 取 ５００ μ Ｌ 上述样品加入等体积的酚  氯仿 （ 体积比 １∶１ ）， 上下颠倒混匀 ， ４℃１２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ 。 ８ ． ４ 　 转移上清液到另一个 １．５ｍＬ 离心管中 ， 加入 ８００ μ Ｌ 无水乙醇 ， －２０℃ 静置 １０ｍｉｎ 。 ８ ． ５ 　 ４℃ ， １２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ ， 弃去所有液相 。 ８ ． ６ 　 用 １ｍＬ７０％ 乙醇漂洗 ， ４℃１２０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 。 ８ ． ７